论文部分内容阅读
YM蛋白是从姚虻唾液腺中分离得到的一种具有水解纤维蛋白原和抑制血小板聚集的双功能蛋白，且具有较高的体内活性，是一种极具应用前景的新型抗血栓药物。为了满足重组蛋白YM的规模化生产，本论文在完成构建重组菌BL21-pET30a-YM的基础上，对重组YM的诱导表达，以及包涵体蛋白复性进行了相关研究，为YM蛋白的规模化生产提供技术支撑。主要研究内容如下: (1)优化了重组菌BL21-pET30a-YM的诱导表达条件。最佳诱导条件为:重组菌BL21-pET30a-YM在TB培养基下37℃发酵3h后加入终浓度为3g/L的乳糖，37℃下诱导8h得到的重组蛋白YM表达量最高。 (2)确立了重组YM包涵体的最佳洗涤和溶解条件，并研究了重组YM包涵体的稀释复性工艺。结果表明:重组YM包涵体的最佳洗涤条件为2mol/LUrea,500mmol/L NaCl,0.5％ TritonⅩ-100,50mmol/L Tris-HCl,pH8.0;重组YM包涵体的最佳溶解条件为:100mmol/LDTT，6mol/LUrea，50mmol/LTris-HCl, pH8.0。 包涵体稀释复性的最佳条件为:在包涵体蛋白溶解液中加入复性缓冲液(50mmol/L NaCl，5％甘油，2mol/L尿素，GSH和GSSG分别为5mmol/L和5mmol/L,50mmol/L Tris-HCl，pH8.0），使得蛋白终浓度为0.2mg/mL，于4℃下复性450min。 (3)使用Source15s阳离子交换树脂对重组YM包涵体进行柱上复性和纯化。结果表明，柱上复性的最佳条件为:上样缓冲液（A相）为6mol/L Urea，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0;复性缓冲液（B相）为5mmol/L GSH，5mmol/LGSSG，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0;洗脱缓冲液（C相）为1mol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl，pH8.0。具体复性方法为:将Source15s阳离子交换柱(10mL)以A相平衡，流速为1.0mL/min;加入溶解的YM包涵体蛋白使其吸附于色谱柱;逐渐提高B相浓度0～100％20min，流速为1.0mL/min;最后在0～50％C30min流速为1.0mL/min的条件下对目的蛋白进行洗脱。 (4)对经复性、纯化的重组YM进行大鼠体内的活性检测。结果表明，在大鼠动脉中重组YM蛋白有明显的抗血栓作用，具有能够延长大鼠动脉中血栓的形成的时间和抑制大鼠动脉中血栓的蛋白含量的作用，0.8mg/kg重组YM蛋白的作用强度与25mg/kg奥扎格雷相当。