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精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是雄性生殖系干细胞,位于睾丸的曲细精管基膜上,既具有自我更新潜能,又具有定向分化潜能,是自然状态下出生后动物体内在整个生命过程中进行自我更新并能将基因传递至子代的唯一成体干细胞。已有诸多研究对小鼠等模式动物的SSCs的分离、培养、增殖以及分化进行了研究。利用SSCs作为宿主细胞制作转基因动物也已经成为一条新的转基因技术途径被广泛关注和研究。但是家畜SSCs的分离培养及分子标记等研究尚不深入,迄今为止未获得纯的SSCs群体,也未有成功建系的报道。本研究主要进行五指山小型猪SSCs的分离、培养和分子特征的鉴定,为制作转基因动物打下基础。1、实验以五指山小型猪为细胞来源材料,对9～12日龄,二月龄,四月龄的五指山猪睾丸做切片观察,发现相比之下9～12日龄的曲细精管中细胞形态比较单一,生精上皮还没有进入生精周期,精原干细胞比较多,所以选择此时期的雄性五指山小型猪的睾丸进行试验。2、为了探讨不同饲养层对SSCs增殖的影响,本实验以STO、PEF、MEF、猪Sertoli细胞作为饲养层进行比较培养,并最终确定以Sertoli细胞制备饲养层。3、本实验采取两步酶法消化睾丸组织获得单细胞悬液,将所得的单细胞悬液经Percoll法和贴壁分选法两种方法去除杂细胞,Percoll法回收精原细胞纯度达到82%以上,差速贴壁法回收的精原细胞纯度60%左右。差速贴壁法的细胞活力更大一些。4、本试验参考小鼠精原干细胞长期培养的方法加以改进,得到了较理想的猪SSCs培养体系。因为考虑到高浓度血清会加快体细胞增殖,我们没有采用之前国内外经常使用得的10%FBS的培养体系,而是添加了5%的FBS,并且在培养体系内添加SCF、LIF后,促进了猪SSCs的增殖,对精原细胞克隆形态的维持和体积的增大都有促进作用。5、分离的精原干细胞细胞悬液在饲养层上形成克隆样细胞团簇,并可传代后继续增殖,在体外培养最长达两个月;免疫鉴定结果发现五指山小型猪SSCs表达THY-1(CD90)、CD9、intergrinβ-1(CD29)、Gfrα-1以及OCT4等干细胞特征分子,RT-PCR检测证实多个干细胞多潜能性标志基因的表达,同时发现实验获得的SSCs不表达c-kit基因,该基因是向精原细胞分化标志,这说明实验中获得的SSCs较好的保持了未分化状态。本研究在5%FBS,和添加10ng/mL SCF、10ng/mL LIF结合Sertoli细胞饲养层的培养体系下体外培养猪精原干细胞,维持猪的SSCs在体外存活增殖两个月。同时,对SSCs的分子特征鉴定也为进行高效免疫分选提供参考,为将来结合移植技术等开展深入研究,利用SSCs转基因技术生产转基因猪提供了新的途径。