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普通小麦(Triticum aestivum)是世界上最重要的农作物之一。节节麦(Aegilops tauschii)是普通小麦D基因组的供体,并且含有比普通小麦D基因组更为丰富的遗传变异,从而成为小麦育种中重要的遗传资源。高分子谷蛋白亚基是小麦籽粒中一类重要的贮藏蛋白,其组成和含量与小麦的加工品质密切相关。目前已在节节麦中发现了许多普通小麦中不存在的特有高分子谷蛋白亚基类型,例如D~tx1.5+D~ty10。品质分析推测D~tx1.5+D~ty10亚基可能与小麦优质烘烤品质有关,因此对节节麦高分子谷蛋白亚基的研究将有助于进一步改良小麦品质。 利用一种新的基于限制性内切酶的方法——限制性缺失法,本研究测定了D~tx1.5+D~ty10亚基编码基因全长开放阅读框的DNA序列并进行原核表达,为研究D~tx1.5+D~ty10亚基的结构与功能奠定了基础。序列比较显示D~tx1.5和D~ty10亚基都具有与已知亚基相同的基本结构。值得注意的是,节节麦的D~ty10亚基和普通小麦的Dy10亚基的中间重复区氨基酸序列具有较大的差异,证实了这两个具有相同SDS—PAGE迁移率的亚基是两类不同的亚基。根据不同来源的D~x1.5基因5’段和部分编码区的特征单核苷酸多态位点,本研究设计了一组能特异性扩增鉴定D~tx1.5的AS—PCR引物。这组AS—PCR引物能比传统SDS—PAGE方法更为快速和精确的筛选D~tx1.5+D~ty10亚基,从而有助于利用这对亚基进行小麦育种。 根据高分子谷蛋白亚基编码基因5’端和部分编码区的DNA序列,不同来源的D~tx2.1亚基可以分为两类:D~tx2.1a和D~tx2.1b。利用SSR标记对这些材料D基因组的亲缘关系分析进一步支持了这种分类。同时,序列比较也证实了D~ty10亚基和Dy10亚基是两类不同的亚基。因此基于SDS—PAGE的常规分类方法会对某些高分子谷蛋白亚基进行错误分类,而利用DNA序列多态性对亚基进行分类将是一种更为精确的高分子谷蛋白亚基的分类方法。 PCR介导重组是一种扩增过程中常见的重组现象。本研究比较了扩增高分子谷蛋白亚基编码基因过程中不同PCR程序对PCR介导重组发生的影响,证实了较短的延伸时间有利于重组的发生。对重组产物的序列分析显示PCR介导重组不仅可以在同源基因间发生,也可以在含有重复片段的同一基因内发生。序列比较显示本研究得到的PCR介导重组产物与天然高分子谷蛋白亚基具有相同的基本结构,但它们中间重复区的差异相当大。利用高分子谷蛋白亚基的特异性多克隆抗体,Western杂交实验证实高分子谷蛋白亚基编码基因的PCR介导重组产物可以进行原核表达。因此PCR介导重组是一种产生新的高分子谷蛋白亚基重组类型的有效方法,将为小麦品质改良育种提供丰富的遗传资源,同时也有助于深入研究高分子谷蛋白亚基的结构与功能。