桑黄菌的物理诱变与发酵研究

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为了进一步开发利用桑黄菌这一中药资源,对桑黄菌生物学特性、成分、药理作用等研究现状进行了综述。在资料分析及现有研究的基础上,本课题对桑黄菌的发酵菌株选育、发酵、多糖提取和多糖活性进行了研究。桑黄菌培养生长较慢,不易诱导出分生孢子,只能从菌丝中分离原生质体。原生质体分离及再生适宜的条件为:菌龄为10d的菌丝,以甘露醇作为分离和再生渗透压稳定剂,用1.5%溶壁酶+0.5%崩溃酶的组合酶系酶解,酶解温度为30℃,酶解时间为3h,用改良PDA再生培养基进行再生。四种诱变方式中激光(LA)诱变与激光-紫外线(LA-UV)复合诱变后筛选的变异菌株平均发酵产量分别为11.57+1.86mg/mL和8.52±1.52mg/mL,表现较好;近一步比较发现LA诱变与LA-UV复合诱变的正变异率分别为6.08%和5.52%,LA-UV复合诱变后菌株变异幅度较大,增产潜力较大,在筛选量较大时使用较好。通过原生质体紫外线诱变,选出生长较快的变异菌株S2。以S2的原生质体进行LA-UV复合诱变,经5代筛选,选出5株变异菌株,5株变异株遗传稳定性较好,与出发菌株均产生拮抗作用,酯酶与过氧化物酶的同功酶电泳图谱与出发菌株比较发生了变化。建立了桑黄菌胞内与胞外多糖发酵产量检测方法,检测了选出菌株的发酵产量,多糖发酵产量最高的菌株为SJZ2,比出发菌株增产36.88%。筛选并优化了SJZ2的发酵培养基。发现,最好的碳源为小麦粉,最好的氮源为米糠。优化培养基组成为:小麦粉5.16%、米糠1.38%、磷酸二氢钾0.094%、硫酸镁0.054%。在试验范围内,影响菌丝发酵产量的顺序为:米糠含量>小麦粉含量>磷酸二氢钾含量>硫酸镁含量。经试验验证,回归模型预测性较好。对影响摇瓶发酵产量的单因素进行了试验,在此基础上对发酵工艺进行了优化,优化后的发酵条件是:装瓶量120mL/250mL、接种量17mL、温度26℃、转速135r/min。在试验范围内,影响SJZ2菌丝发酵产量的顺序为:温度>接种量>转速>装瓶量。经试验验证,回归模型预测性较好。研究了摇瓶发酵过程中菌丝产量、发酵液中可溶性蛋白含量、多糖含量、粘度、LiP的活性、MnP的活性、Lac的活性、纤维素酶对羧甲基纤维素的活性和纤维素酶对滤纸的活性动态变化,并测出LiP、MnP、Lac的米氏常数和最大反应速度。在摇瓶发酵的基础上进行了发酵罐发酵试验。试验最佳发酵条件为:装罐量70%、接种量10%、搅拌速度180r/min、温度29℃、空气流量1:0.6v/v.m。在此条件下,3.5L发酵培养基产菌丝68.23±2.51g(n=3),产胞外粗多糖10.23±0.35g(n=3)。用复合酶提取桑黄菌多糖。对提取用酶进行了筛选及复合,筛选得到的提取用酶为:纤维素酶、蜗牛酶、溶壁酶和中性蛋白酶Neutrase,4种酶复合质量比为3:1:0.5:4。在多糖提取单因素研究的基础上,通过优化试验,得到多糖得率最高的提取条件为:pH值6.5、温度40.9℃、提取时间3.78h、加酶量3.37%。多糖纯度最高的提取条件为:pH值6.7、温度34.5℃、提取时间2.35h、加酶量2.57%。在试验范围内,影响多糖得率的顺序为:pH值>加酶量>温度>提取时间。影响多糖纯度的顺序为:提取时间>pH值>温度>加酶量。经试验验证,回归模型预测性较好。对桑黄菌多糖(PIPS)的部分理化性质进行了研究,碘-碘化钾试剂反应为阴性,α-萘酚反应为阳性,斐林试剂反应为阴性,25℃时EPS(胞外多糖)特性粘度为0.85dL/g,IPS(胞内多糖)特性粘度为1.20dL/g。对PIPS进行分级分离,从EPS中得到2个组分EPS0.1和EPS0.2,从IPS中得到8个组分:IPS0.01、IPS0.02和IPS0.1等。对PIPS及部分组分测定单糖组成,得IPS的单糖组成及摩尔比为:1(Xy1):50(Rha):33(Ara):225(Man):375(Glu);IPS0.1的单糖组成及摩尔比为:10(Rha):33(Man):70(Glu);IPS0.01的单糖组成及摩尔比为:9(Man):5(Glu);EPS的单糖组成及摩尔比为:1(Gal):35(Man):35(Glu);EPS0.1的单糖组成及摩尔比为:7(Man):5(Glu);EPS0.2的单糖组成及摩尔比为:13(Man):5(Glu)。桑黄菌多糖的抗氧化活性有较好的量效关系,通过对量效关系曲线回归并计算出:清除DPPH·时,IPS的EC50值为1.09mg/mL,EPS的为1.52mg/mL;清除·OH时,EPS的EC50值为0.23mg/mL,IPS的为0.78mg/mL;清除O2-·时,EPS的EC50值为20.31μg/mL,IPS的为29.97μg/mL;螯合Fe2+时,IPS的EC50值为1.36mg/mL,EPS的为1.66mg/mL;试验范围内IPS的还原能力(y)与IPS浓度(x)的量效关系为:y=1.3023x+0.0178(R2=0.9991),EPS的还原能力(y)与EPS浓度(x)的量效关系为:y=1.8004x+0.0185(R2=0.9992)。
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