一、研究背景与目的新生儿败血症和脑膜炎(neonatal sepsis and meningitis, NSM)是新生儿期感染性疾病中最常见和最严重的疾病,其发病率和死亡率均较高,尤其在早产及低出生体重、极低出生体重婴儿中发病率更高。30%的存活患儿伴有永久性神经系统后遗症,诸如耳聋、癫痫、智力和运动障碍等。新生儿脑膜炎大多由菌血症或败血症引起,其致病菌随着抗生素的广泛应用不断发生变化,近年来表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)成为美国医院内获得性感染最常见的细菌,而中国仍以大肠杆菌(多具有K1抗原,Escherichia coli K 1, E.coli K 1)和葡萄球菌(staphylococcus)为主。E.coli K1株是引发NSM最常见的革兰阴性杆菌,占革兰阴性败血症的50%-60%甚至更高。E.coli K1主要来自母亲的产道或直肠,据报道40%的无脑膜炎新生儿败血症血液或80%新生儿脑膜炎的脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中都可分离到该菌。孕妇因其特殊体质,肠道定植的E.coli K 1株容易易位于阴道,致使新生儿在通过产道时获得感染。E.coli K1株一旦定植于新生儿肠道,0.5%可发生肠道侵袭性定位转移而入血到达中枢神经系统(central nevous system, CNS)血管,接着在该处形成局部血栓释放出细菌栓子并穿过血脑屏障(blood brain barrier, BBB)而引发脑膜炎。细菌性败血症与脑膜炎(bacterial sepsis and meningitis, BSM)的三联特征包括：1)致病菌侵袭；2) NF-κB激活；3)中性粒细胞(polymorphonuclear,PMN)迁移穿透主要由内皮细胞组成的血脑屏障(BBB)。尽管抗生素是治疗细菌性感染疾病的一类重要药物,临床上也有不少针对细菌的抗生素和相关的支持疗法,但随着时间的推移,病原微生物已对现有抗生素产生了明显的耐药性。在过去几十年,耐药性大肠杆菌不断增多,致使新生儿感染包括败血症和脑膜炎病死率和严重的CNS后遗症居高不下,抗生素耐药性问题日益严重地威胁着人类的健康。传统抗生素的抗菌机制是通过与病原微生物体特定部位的受体结合,使病原微生物体的正常结构遭到破坏或使某些生物合成受阻,从而达到抑制或杀灭病原菌的作用。然而,当其作用的靶位点发生改变时,抗生素就会失去抗菌的作用,这是细菌对抗生素产生耐药性的一个主要原因。此外,抗菌素无法识别有害和有益的生物体,在杀死病菌的同时也会破坏体内益生菌,使体内益生菌减少,从而使体内菌群失去平衡。因此,寻找通过宿主相关受体调节宿主免疫系统而不是直接作用于致病菌达到清除体内病原微生物的目的来治疗微生物感染的抗感染药物逐渐成为研究的热点。这种宿主直接干预对抗病原体的方法可能在有效地阻断病原菌感染的同时,降低病原微生物产生耐药性的可能性,将突破传统单纯针对病原微生物的抗感染治疗瓶颈。目前,治疗BSM面临的最主要的问题,就是缺乏针对上述三联特征的有效的治疗干预措施。我们前期研究发现a7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor, a7 nAChR)是神经递质介导的离子通道受体,是一种关键的炎症调节因子,在E.coli K 1株入侵宿主,PMN迁移穿越BBB和新生儿神经炎症即细菌性脑膜炎的三联特征中起着至关重要的作用。a7 nAChR激动剂尼古丁(Nicotine, NT)能显著激活BSM的三联特征,而使用a7 nAChR抑制剂甲基牛扁碱(methyllycaconitine, MLA)或基因敲除技术阻断a7 nAChR可显著抑制BSM的三联特征表现。因此宿主受体a7 nAChR有望成为独特的治疗BSM的药物靶点。盐酸美金刚(memantine hydrochloride, MEM)是一种FDA批准的用于治疗中、重度阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的药物,同时也是宿主受体α7 nAChR非竞争性抑制剂。已有研究显示,MEM能影响大鼠或健康受试者的认知；在大鼠海马神经元中,MEM抑制α7 nAChR的效果(ICso=0.34μM)显著高于NMDAR(IC50=5.1μM),这表明MEM的治疗作用与宿主α7 nAChR密切相关。另外,有研究显示,阻断宿主α7 nAChR表达可明显降低MEM对AD的疗效,激活α7 nAChR对成年人有保护的作用,但对新生小鼠却有损害的作用,这与我们的先前研究结果相一致。目前,随着国内外研究的深入,MEM已广泛地应用于临床并尝试用于多种其他疾病的治疗。这种药物重新定位的方法与传统的药物相比,不仅能降低成本、风险及上市时间,还可以理想地满足治疗罕见疾病的需求。这往往是开发传统的常见病治疗药物所忽视的。在本研究中,我们采用药物重新定位的方法,利用BBB的体内外模型系统,检测MEM是否可用作直接针对宿主的抗微生物制剂来对抗BSM的三联特征。新生儿由于免疫系统不健全、体内屏障系统包括BBB发育尚未成熟,加之缺乏特异性免疫抗体,极易引发细菌性脑膜炎。大部分新生儿BSM是细菌血源性传播的结果。大肠杆菌进入血液循环后定植引起菌血症或败血症,经血流播散穿越BBB进入CNS后到达脑脊液,是大肠杆菌性脑膜炎的重要发病机制。因此,抑制血液循环中致病菌的繁殖是治疗BSM的关键。据此,本研究亦探讨MEM的具体抑菌和杀菌机制。PMN是一类重要的吞噬细胞,其抑菌杀菌机制是通过细胞内机制实现的,包括吞噬、灭活、消化等。同时,星形胶质细胞(Astrocyte Cells)是哺乳动物脑内分布最广泛的一类神经胶质细胞,具有吞噬功能。为了探讨MEM的杀菌和治疗BSM的具体机制,我们重点研究MEM对PMN和星形胶质细胞吞噬病原菌的影响及其作用机制。MEM是否能提高PMN和星形胶质细胞的吞噬及杀菌功能,MEM的杀菌机制与宿主受体α7 nAChR的关系等都是本研究希望探索的内容。细胞生物学中关于中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)的系列研究进展为我们研究MEM在血液循环系统中的杀菌机制提供了新的思路。除了通过吞噬作用杀死病原菌外,激活的PMN还会通过奇特的程序性死亡(programmed cell death)释放核内的核苷酸、杀菌酶(如髓过氧化物酶,myeloperoxidase, MPO)和杀菌蛋白(S100A9),在胞外形成一张网络,即NETs,将入侵的细菌捕获消灭。MEM在提高PMN吞噬功能的同时能否诱导NETs的形成而参与捕杀细菌的过程也是本文希望探讨的内容,从而更好地阐述MEM治疗BSM的具体作用机制,为临床应用打下坚固的基础。围绕以上线索,本文主要开展以下几方面的研究：(1)利用体外细胞模型探讨MEM的药物靶向性；分析比较n-甲基-d-天冬氨酸受体(n-methyl-D-aspartate receptors, NMDARs)和α7 nAChR抑制剂MEM对抑制致病菌E44入侵宿主的异同；使用siRNA技术下调CHRNA7基因表达后检测MEM对致病菌E44入侵HBMEC的影响,确定MEM是否通过抑制宿主α7 nAChR来阻断NT增强致病菌E44穿透BBB的能力；(2)通过体外细菌的侵袭实验和体内新生小鼠BSM模型探讨MEM对致病菌入侵组织屏障的影响；(3)利用体内外模型系统检测MEM对相关炎症通路和脑损伤的影响；(4)探讨MEM防治细菌性败血症和脑膜炎的作用机制；通过PMN的吞噬杀菌实验和免疫荧光实验,体外分析MEM对PMN吞噬杀灭致病菌的影响；检测宿主受体α7 nAChR和杀菌蛋白S100A9在其杀菌机制中的相互作用；采用NETs实验试剂盒和免疫荧光的方法分析检测MEM对NETs形成的影响,进一步确定MEM的具体杀菌机制；(5)体外HBMEC细胞模型系统和体内血源性新生小鼠BSM模型系统检测MEM与抗生素的联合应用防治BSM的效果。二、研究方法与结果1、MEM的药物靶向性研究1)检测MEM的药物靶向性及其作用靶点,明确MEM的杀菌功能是否与宿主α7 nAChR有关。HBMEC与NT作用48 h后,加入不同剂量的MEM进行处理并进行细菌的侵袭实验。结果显示,与对照组相比,MEM可明显阻断NT增强E44侵袭的效果,并呈剂量依赖性；当NT的使用剂量为10μM时,50μM MEM处理组中E44的相对侵袭率为35%(P<0.05)。2)为了明确MEM的作用靶点,比较分析NMDARs和α7nAChR激动剂和阻断剂对胞内致病菌E44存活的影响的异同。在细菌的侵袭实验中分别加入不同剂量的NMDARs和α7 nAChR激动剂(NT和NMD A)以及α7 nAChR阻断剂MEM、两种NMDARs抑制剂犬尿素(kynurenic acid, Kyn)和右美沙芬(dextromethorphan, DM)。结果发现,与MEM处理组相比,Kyn和DM并不能抑制胞内细菌的存活。与此同时,我们还发现,与α7 nAChR激动剂NT相同处理剂量(10μM)的NMDA并不能明显提高细菌E44侵袭HBMEC的能力。3)为了进一步证明MEM的杀菌功能与宿主α7 nAChR有关,我们使用siRNA技术下调CHRNA7基因在HBMEC中的表达。HBMEC分别转染质粒α7 nAChR siRNA和scrambled siRNA, Western Blot显示HBMEC细胞中CHRNA7基因的下调效果达80%左右。与对照组相比,CHRNA7基因下调后,NT诱导的增强E44侵袭HBMEC的效果明显被阻断(P<0.05),同时,MEM的抑菌效果明显减弱,MEM对E44的半数抑制量ICso大大提高,为25.57μM (P<0.05)。4)为了确定MEM的药物靶向,我们同时检测MEM的体外抗菌活性,在体外培养E44的同时加入不同浓度的MEM,分别在37℃孵育1至8 h后检测其吸光度(OD600)并绘制细菌生长曲线,结果发现MEM并不影响E44的体外生长。不同剂量的MEM处理组的E44生长曲线与对照组无显著差异。2、探讨MEM对细菌入侵组织屏障的影响1)为了研究MEM对大肠杆菌感染的影响,我们首先检测MEM对致病菌E44侵袭HBMEC的抑制效果。在脑膜炎致病菌E44感染HBMEC的不同时间点(感染前、感染同时和感染后)加以不同浓度的MEM进行干预处理,结果发现MEM在不同的时间加以处理均可明显抑制细胞内致病菌E44的存活率(P<0.05),并呈剂量依赖性；其中MEM与细菌同时作用时效果最显著(P<0.001),当MEM使用浓度为50μM时,E44的相对侵袭率仅为10%左右。2)为了证实体外实验中关于MEM的生物学功能,我们建立了新生小鼠BSM的体内模型系统。首先检测MEM是否可治疗新生小鼠BSM,7-9日龄小鼠在大肠杆菌E44感染的同时腹腔注射给予不同剂量的MEM,感染18 h后,血样本及脑脊液(CSF)样本倍比稀释后涂布LB平板计算菌落数,结果显示MEM处理组中新生小鼠血液和脑脊液中细菌存活量显著降低(P<0.05),菌血症及脑膜炎感染率分别为14.4%和0；小鼠外周血中血脑屏障损伤细胞标志物cBMEC的数量明显降低(P<0.05)。3、探讨MEM对炎症通路及脑损伤的影响1)为了检测MEM对炎症反应的影响,我们利用体外细胞模型系统检测MEM对PMN迁移穿越血脑屏障的影响;HBMEC与NT作用48 h后,进行PMN的迁移实验并加入不同剂量的MEM进行处理。结果显示MEM可明显抑制NT增强PMN迁移穿透HBMEC的效果,并呈剂量依赖性；与对照组相比,当NT的使用剂量为10μM时,50μM MEM处理组中E44的相对迁移率为38%(P<0.05)。2)为了检测MEM对体内相关炎症通路及脑损伤的影响,7-9日龄小鼠在大肠杆菌E44感染的同时腹腔注射给予MEM,感染18h后,提取CSF样本进行分析。ELISA实验结果显示,MEM处理组小鼠CSF中炎症因子MMP 9和p65的表达量明显减少(P<0.05)。免疫组化实验结果表明,与对照组相比,MEM治疗后,细菌性感染新生小鼠脑损伤及老化程度明显降低。4、MEM的杀菌机制研究1)我们前面研究显示MEM可显著降低新生小鼠BSM,为了进一步探讨MEM的杀菌机制,我们通过PMN和星形胶质细胞的吞噬及杀菌实验检测MEM对PMN和星形胶质细胞吞噬及杀菌功能的影响。PMN和Astrocyte细胞与一定数量E44孵育的同时加以MEM处理1 h,存活细菌数量通过涂布平板计算菌落数。吞噬实验结果显示,与对照组相比,MEM可显著增强PMN和Astrocyte细胞的杀菌功能,当MEM的使用剂量为50gM时,与对照组相比,E44的相对存活率为38.5%和35%(P<0.05)；不同MOI的PMN与带有GFP标记的大肠杆菌K1株E44 (E44-GFP)孵育的同时与一定量的MEM(50μM)作用,荧光显微镜检测E44-GFP被PMN吞噬的情况。结果显示,加MEM处理后,PMN能吞噬更多的致病菌(P<0.05),表明MEM能提高PMN的吞菌功能。2)前面研究显示宿主α7 nAChR对MEM抑制E44侵袭和PMN迁移穿透BBB起着重要的作用。因此为了进一步探讨MEM的具体杀菌机制及探索宿主受体α7nAChR与杀菌蛋白S100A9在其杀菌机制中的相互作用,我们采用siRNA技术,沉默经1.3% DMSO处理分化完全的HL60细胞(dHL60)中CHRNA7与S100A9基因的表达,Western Blot的方法检测其下调效果。结果发现,下调dHL60中CHRNA7基因的表达后(下调效率达80%),S100A9基因的表达明显降低(P<0.05)；而S100A9基因表达的降低对CHRNA7的表达没有明显影响。说明S100A9基因的表达受α7 nAChR的调控。已有研究表明,S100A9蛋白具有杀菌功能,通过PMN的吞菌实验显示,下调CHRNA7基因的表达后,致病菌E44的存活率显著降低,与对照组相比,E44的相对存活率为55%(P<0.05), MEM的杀菌功能被阻断；而下调S100A9基因的表达后,致病菌E44的存活率显著升高(P<0.05)。3)我们采用免疫荧光技术的方法,PMN与MEM和E44共同孵育1 h后,与CHRNA7与S100A9抗体共同孵育过夜,免疫荧光显微镜观察两者之间的表达情况及相互作用。以非处理组中PMN的CHRNA7与S100A9的表达为对照,结果发现,加E44刺激后,α7 nAChR和S100A9蛋白在细胞边缘及细胞核周围的表达升高,α7 nAChR与S100A9蛋白的结合作用明显增强；经软件Image J分析发现两者高度结合(R接近1)；然而加MEM处理后,这种相互结合作用明显降低。4)已有研究显示,PMN除了吞噬功能之外,中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)的形成释放核内的核苷酸、杀菌酶(如髓过氧化物酶,myeloperoxidase, MPO)和杀菌蛋白(S100A9)等能捕杀病原体,我们的研究也证明MEM有助于PMN吞噬杀菌。因此我们推想MEM是否能诱导NETs的形成而参与捕杀细菌的过程。在本研究中,分离正常人外周血PMN后,我们采用NETs试剂盒的方法定量分析MEM和E44刺激PMN后对诱导NETs形成的影响,结果发现MEM能刺激PMN相关弹性蛋白酶和杀菌蛋白的释放,NETs含量增加,表明MEM参与诱导NETs的形成。另外,采用免疫荧光染色方法评价NETs生成情况。与对照组相比,MEM体外刺激PMN4h后产生大量胞外网状结构(NETs),该结构还包含DNA,杀菌蛋白如钙调蛋白S100A9和杀菌酶髓过氧化物酶(MPO)等成分。5、探讨MEM与抗生素的联合治疗新生小鼠BSM的效果为进一步阐述MEM能防治新生儿细菌性败血症和脑膜炎,解决抗生素的细菌耐药性问题,我们通过体内外实验发现MEM和抗生素Amp联合使用的抑菌效果明显高于单独使用(P<0.05),并具有协同作用(CI<1)。7-9日龄小鼠感染致病菌E446 h后腹腔注射MEM和Amp治疗14 h,结果发现联合治疗组的细菌感染率明显降低(P<0.05)。三、统计学分析数据均表示为均数±标准差(Mean±SD)。两组间的比较采用t检验(student’s ttest),多重比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。动物实验阳性率的比较采用Pearson卡方检验。P<0.05认为差异有统计学意义,检验水准为a=0.05。数据分析和图表制作采用软件SPSS 13.0和GraphPad Prism 5.0。四、结论MEM能阻断BSM的三联特征包括：1)致病菌入侵；2)NF-κB激活；3)PMN迁移穿透BBB,从而达到治疗新生儿BSM的目的。在BSM前期,即菌血症或败血症期,我们推测MEM的杀菌作用机制可能是通过抑制α7 nAChR,解聚PMN中E44介导的中高度聚合的α7 nAChR和S100A9蛋白,释放部分S100A9并结合MEM诱导形成的NETs中的其他杀菌蛋白酶(MPO)、核酸DNA、杀菌肽(如,LL-37)等提高抗菌活性,并通过其网状结构捕获并杀灭细菌,从而抑制E44在血液中繁殖,达到预防脑膜炎的目的。在BSM后期,即脑膜炎期,我们推测MEM的杀菌作用机制可能是通过阻断BSM的三联特征,增强神经胶质细胞的吞噬杀菌功能,从而修复致病菌所致BBB损伤,减轻炎症反应和脑损伤达到治疗脑膜炎的目的,但其具体机制有待进一步研究。同时,MEM能联合抗生素协同防治新生小鼠BSM,这种通过直接干预宿主受体对抗病原体的方法可以在有效地阻断病原菌感染的同时,降低病原微生物产生耐药性的可能性,将突破传统单纯针对病原微生物的抗感染治疗瓶颈。