铜绿微囊藻是滇池蓝藻水华的主要优势藻种，具有强的抗逆性和适应性，这是该种在世界范围内广泛分布和形成蓝藻水花的重要原因。在自然水体中铜绿微囊藻常以群体的多细胞结构存在，群体形成是其适应和抗逆性产生的原因之一。研究发现许多生物因子和非生物因子都能诱导蓝藻群体的形成，但群体形成的特点及分子机制还不清楚。本研究小组发现细菌对诱导铜绿微囊藻表型转换具有重要作用，并发现在细菌诱导的铜绿微囊藻表型转换过程中，存在细胞型分化现象。本研究拟进一步分析铜绿微囊藻表型转换过程中，不同细胞型的特点和分化机理，及其在适应性产生和异常增殖中的潜在作用。以前期筛选出的韦氏气单胞菌（Aeromonasveronii）菌株N12为材料，利用其能稳定诱导铜绿微囊藻形成群体的特点，建立基于N12菌与铜绿微囊藻共培的研究体系，追踪铜绿微囊藻细胞的聚集过程，和这一个过程中藻细胞形态结构、生理生化指标和表型转换相关基因表达的动态变化，以探索细胞型分化的特点和产生的原因。利用DAPI染色藻细胞拟核区结合叶绿素自发荧光，荧光显微观察群体形成中藻细胞形态及结构;利用外加实验，研究信号分子AHLs和ABA对细菌诱导的藻表型转换过程的影响;利用Q-PCR技术筛选出四类与藻细胞聚结相关的基因（碳酸酐酶相关基因ecaB、藻毒素相关基因mcvA和mcyB、胞外多糖相关基因epsL以及伪空泡相关基因gvpA2），进一步采用荧光原位杂交技术就聚团过程中这五种基因的表达情况进行原位分析，并和自然水体微囊藻群体进行比较，得到的主要结果如下:　　1.研究体系的建立——菌N12诱导铜绿微囊藻表型转换及其特点。铜绿微囊藻在与N12菌共培下能形成群体，群体形成分不同的两个阶段:小群体的聚团（游离细胞的抱团）和大群体的聚结;群体形成的大小和速率具有浓度依赖性;形成的结构与自然群体具有较高的相似性;群体形成中，藻细胞的胞内外可溶性多糖含量急剧增加，藻胆蛋白和别藻蓝蛋白含量发生改变，共培36h和48小时，为对照组的3.89和3.77倍，3.98和4.06倍;膜脂过氧化产物丙二醛含量在群体形成初期急剧上升，之后下降。　　2.铜绿微囊藻表型转换过程中细胞型的分化。DAPI染色结合叶绿素自发荧光观察发现:不管是自然群体，还是菌诱导产生铜绿微囊藻群体，都存在两种细胞型:A型细胞(Apoptosis cell)和R型细胞(Resistance cell)。A型细胞较大，胞质绿，内含深色不规则分布颗粒，荧光下拟核区大，结构较松散，胞质中叶绿素自发荧光的红色明显低于R型细胞，其中还分布有黄色透明颗粒，这种黄色颗粒的数目随发育进程而增加;而R型在明视场下，细胞较小，胞质较浅，胞内所含内含物少，除核心部分可见拟核所在的结构之外，基本不含其他结构，荧光下呈明亮的红色。随着聚团过程的进行，A型细胞比率增加，在与N12共培24h时最高（是R型细胞比率的7.71倍），与N1菌共培12h时最高（是R型细胞的5.1倍）;培养后期，R型细胞比例慢慢增加，与N12菌共培48h时R型细胞所占比率数是A型的2.15倍，与N1菌共培60h时R型细胞比率是A型的8.1倍。两种细胞型比例的变化，揭示在群体形成中存在细胞型的更替。　　3.AHLs和ABA对细菌诱导铜绿微囊藻表型转换及细胞型分化的影响。外加AHLs能提高菌N12胁迫下铜绿微囊藻的存活率，加速藻细胞聚团速率，形成更大团块。外加AHLs改变群体细胞中细胞型组成，增加了R型细胞所占比率，48h达到81.53％;外加ABA到藻-N1的共培组中，随共培时间R型细胞逐渐增加，48h所占比率达到A型细胞的8.95倍，“AHLs—藻”和“ABA—藻”处理组各个时间段两种类型细胞所占比率无明显差异。　　4.运用荧光原位杂交技术，分析五个基因在正常培养周期和菌诱导的聚团过程中表达的动态变化，及外加AHLs对它们的影响，并和在自然群体中的表达情况进行了对比。结果如下:　　1)碳酸酐酶相关基因ecaB:该基因主要在周质中表达，荧光成点状分布，并在处于分裂期的细胞中表达强烈。N12菌能明显诱导该基因的表达，在共培24h表达量最高，之后下降（共培36h-48h）;外加AHLs后该基因在24h有一个表达高峰，之后下降;外加AHLs将N12对藻细胞该基因表达的诱导提前(12h vs24h);从细胞型分布看，该基因多在R型细胞中表达。　　2)藻毒素相关基因mcvA和mcyB:两种基因的荧光在胞内呈点状和片状分布，在纯培养的铜绿微囊藻细胞中较少表达。N12菌诱导两种基因的表达，mcyB基因较mcyA基因受诱导更强烈;外源AHLs能诱导纯培养的处于早期生长阶段(6-24h)细胞中两种基因的表达，而降低与菌共培的藻细胞中两种基因的表达。对应细胞的形态和结构，两基因主要在A型细胞中表达，在凋亡残体中荧光强度也较高。　　3)伪空泡相关基因gvpA2:该基因的荧光均匀分布于全细胞。在对数生长期的细胞表达最高，随细胞进入静止期而下降;N12菌对该基因的表达具有明显抑制作用;外源AHLs对正常生长藻细胞中该基因的表达无明显影响，但加强了N12菌对该基因的抑制效应。从细胞型分布看，该基因多在R型细胞中表达。　　4)胞外多糖相关基因epsL:该基因的荧光均匀分布于全细胞。在单独培养的铜绿微囊藻细胞中，该基因主要在培养后期表达。N12菌共培和外加AHLs分子都能分别诱导藻细胞epsL基因表达的增强;在藻菌共培下，外加AHLs抑制N12对epsL基因表达的诱导。epsL基因的高表达对应于那些凋亡和解体的A型细胞。　　5)自然水体微囊藻群体中五种基因的表达和N12菌诱导群体中的表达相似。从各基因表达的胞内定位看，自然群体细胞中碳酸酐酶基因ecaB的荧光分布在周质，藻毒素相关基因mcyA和mcyB荧光也呈现出点状和片状，而gvpA2和epsL基因的荧光则均匀分布于全细胞;从细胞型的基因表达分布看，自然群体中ecaB和gvpA2多在R型细胞中表达，而mycA/B及epsL更多的在A型细胞中表达。　　综上所述，细胞型的分化存在于细菌诱导的铜绿微囊多细胞群体和自然群体中，不同细胞型在外部形态，内部结构和基因表达和发育方面存在极大的差异。群体形成过程伴随了不同细胞型的分化和更替，影响铜绿微囊藻聚团和抗逆性的外源信号物质，也通过改变细胞型的分布和更替而发挥作用。由此可以推测，铜绿微囊藻聚集形成多细胞团块结构，不仅仅是为了抵御捕食而增加进食障碍，还为细胞型分化和更替提供物理和生理生化的可能，群体所形成的差异微环境，能导致不同部位的细胞最终在形态，生理生化特征和基因表达方面出现差异，导致不同细胞型的产生。而细胞型分化和更替为适应性和抗逆性的产生提供了基础。此外，细胞型分化和更替涉及复杂的胞间通讯和信号传递过程，群体感应QS信号分子和抗逆信号分子ABA对此过程均有明显的影响。这些结果在一定程度上为揭示水华蓝藻表型转换和抗逆性产生机理奠定了基础。