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背景肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是指起源于肾脏上皮细胞的癌症,在肾脏恶性肿瘤中占比超过90%,包含了超过10种以上的组织病理学及分子病理学的亚型,其中肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,cc RCC)是最常见的病理类型,研究表明,大约75%的肾细胞癌是肾透明细胞癌。流行病学调查表明,在过去的20多年中,肾细胞癌全球发病率每年增加2%;世界范围内,肾细胞癌年龄标化患病率和死亡率分别是每10万人6人患病和每10万人2.1人死亡。尽管肾细胞癌诊疗技术取得很大进展,大约有20%~30%的肾细胞癌患者出现远处转移;出现转移的肾细胞癌患者预后较差,5年存活率大约8%。随着对肾细胞癌发病机制认识的加深,近年来发展出了肾细胞癌的免疫疗法和靶向疗法,但是到目前为止,没有一种药物能够取得100%的反应率和疾病的持久的缓解,对肾细胞癌的治疗仍需要发展新的辅助疗法。中国传统医学(Chinese traditional medicine,CTM)为现代西方医学的发展提供了一种替代的路径,特别是其中的中草药(herbal medicine),近年来在治疗许多慢性疾病包括肿瘤等方面中草药及其提取的活性成分得到越来越多的关注和研究。虫草素(cordycepin)是从中国传统中药冬虫夏草(Cordyceps militaris)中提取的主要活性成分,过去在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和白血病等肿瘤中的的研究表明,虫草素具有广谱的抗肿瘤活性,但虫草素在肾细胞癌中的抗肿瘤活性及其作用的相关分子机制仍需要进一步深入研究。目的探讨虫草素(cordycepin)对肾透明细胞癌存活、迁移能力的影响,并初步研究虫草素在肾透明细胞癌中抗肿瘤作用的分子机制,为未来虫草素辅助治疗在肾细胞癌方面的潜在临床应用奠定实验理论基础。方法1.不同浓度(10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml)虫草素处理Caki-1肾透明细胞癌细胞48小时,CCK-8(cell counting kit-8)细胞活力检测试剂测定细胞存活情况;Caspase-3半胱天冬酶活性测定试剂盒测定细胞中Caspase-3活性。2.30μg/ml的虫草素和50μmol/L的半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk同时处理Caki-1肾透明细胞癌细胞48小时,设空白对照和半胱天冬酶抑制剂z-VADfmk未处理对照,CCK-8细胞活力检测试剂盒测定细胞活力;Western Blot技术检测凋亡标志蛋白PARP(poly ADP-ribose polymerase)和caspase-3的切割。3.Transwell小室细胞迁移实验分析10μg/ml的虫草素处理24小时和48小时对Caki-1肾透明细胞癌细胞迁移能力的影响。4.10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml的虫草素处理Caki-1肾透明细胞癌细胞,Western Blot技术检测虫草素对磷酸酶PTEN(Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10)水平、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt磷酸化水平的影响;实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,Q-PCR)检测虫草素处理对Caki-1肾透明细胞癌细胞中micor-RNA-21(mi R-21)表达水平的影响。5.通过转染mi R-21 mimic或者PTEN小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)在Caki-1肾透明细胞癌细胞中降低PTEN表达,Western Blot实验验证PTEN敲低表达效果,CCK-8细胞活力测定试剂盒测定在Caki-1肾透明细胞癌细胞中敲低PTEN表达对虫草素促进Caki-1肾透明细胞癌细胞凋亡性死亡的影响;Transwell小室细胞迁移实验检测在Caki-1肾透明细胞癌细胞中敲低PTEN表达对虫草素抑制Caki-1肾透明细胞癌细胞迁移的影响。结果1.CCK-8细胞活力测定实验结果显示,与对照相比,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml,50μg/ml虫草素处理Caki-1肾透明细胞癌细胞48小时,Caki-1细胞活力明显下降(P<0.05 vs.对照),呈浓度依赖模式;随着虫草素处理浓度的逐渐升高,Caki-1肾透明细胞癌细胞裂解液中凋亡标志物caspase-3蛋白活性逐渐升高(P<0.05 vs.对照)。在50μmol/L的半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk存在的情况下,虫草素(30μg/ml)诱导的Caki-1肾透明细胞癌细胞死亡被显著抑制(P<0.05);Western Blot实验结果显示30μg/ml虫草素处理Caki-1肾透明细胞癌细胞导致凋亡相关蛋白PARP的切割和caspase-3半胱天冬酶的切割激活,而50μmol/L的半胱天冬酶抑制剂z-VAD-fmk处理可以显著抑制PARP和caspase-3蛋白的切割。2.Transwell小室细胞迁移实验结果显示,与对照相比,10μg/ml的虫草素处理能显著抑制Caki-1肾透明细胞癌细胞的跨膜迁移(P<0.05 vs.对照)。3.Western Blot实验结果表明,与对照相比,10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml的虫草素处理Caki-1肾透明细胞癌细胞能显著上调PTEN表达水平(P<0.05 vs.对照)和下调蛋白激酶Akt磷酸化水平(P<0.05 vs.对照),且呈一定的浓度依赖的模式。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照相比,随着虫草素作用浓度(10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml)的升高,Caki-1肾透明细胞癌细胞mi R-21表达水平逐渐降低(P<0.05 vs.对照)。4.Western Blot实验结果显示,在Caki-1肾透明细胞癌细胞中转染mi R-21mimic或者PTEN si RNA均可降低PTEN蛋白表达水平;CCK-8细胞活力测定结果表明,mi R-21 mimic或者PTEN si RNA转染Caki-1肾透明细胞癌细胞均可抑制30μg/ml的虫草素处理诱导的细胞死亡(P<0.05);Transwell小室细胞迁移实验结果显示,mi R-21 mimic或者PTEN si RNA转染Caki-1肾透明细胞癌细胞均可减弱10μg/ml的虫草素处理对细胞迁移的抑制(P<0.05)。结论虫草素(cordycepin)处理肾透明细胞癌细胞系Caki-1细胞可降低mi R-21表达,升高PTEN磷酸酶表达;通过调控mi R-21和PTEN表达水平,虫草素可诱导肾透明细胞癌细胞系Caki-1的凋亡性细胞死亡,抑制肾透明细胞癌细胞系Caki-1的迁移能力;虫草素在治疗肾细胞癌方面具有潜在的临床应用价值。