中国小麦花叶病毒RNA2亚基因组及其编码的CRP蛋白功能分析

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中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起小麦花叶病的重要病原之一,常导致小麦减产10%-30%。CWMV由禾谷多粘菌传播,属于帚状病毒科(family Virgaviridae)真菌传杆状病毒属(genus Furovirus);其基因组包含2条单链正义RNA,编码7个病毒蛋白,包括复制酶、运动蛋白(MP)、外壳蛋白(CP)和富含半胱氨酸的蛋白(CRP)等。其中,CRP蛋白被认为是一个较弱的沉默抑制子,然而,进一步的功能研究尚未见报道。因此本研究主要采用了Northern-blot、5’-RACE、遗传转化等技术分析CRP基因的表达特性及其在寄主植物中的功能活性。本研究首先以CRP编码区为探针进行了Northern-blot分析,结果显示除了CWMV全长RNA2杂交条带之外,病株中还含有一条编码CRP蛋白的亚基因组RNA(Subgenomic RNA,sgRNA)条带;5’-RACE实验表明该sgRNA的转录起始位点位于nt 2533处。接着我们又通过原核表达体系成功表达纯化了CRP蛋白,并制备了该蛋白的特异性抗体;Western-blot分析显示CRP蛋白可在病株中高丰度地表达。为了深入分析CRP功能,我们又采用农杆菌介导的遗传转化技术将CRP基因导入本氏烟,成功获得了5个过表达CRP的转基因株系,表型观察分析发现转CRP基因本氏烟(Nicotiana benthamianae)呈现明显的黄化、矮小等表型;叶绿素含量和光合速率测定表明过表达CRP显著抑制叶绿素合成和光合作用;提取转基因植株总RNA和总蛋白分别进行转录组、蛋白组分析,GO和KEGG富集分析一致性表明过表达CRP植株的光合作用途径受到显著影响,进一步的定量分析也证实了CRP蛋白对植物光合作用途径的抑制功能。上述结果将有助于了解CWMV基因表达调控的策略,并为阐明CWMV的致病机制奠定基础。
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