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目的高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)是动脉粥样硬化和高血压病的一个新的、重要的、独立的危险因素,与心血管疾病的发生、发展密切相关。血浆中高水平的Hcy可以刺激血管的内皮细胞,诱导其损伤,进而影响血管的正常功能,导致心血管系统疾病。大黄素甲醚(physcion,Phys)是大黄的主要有效成分之一,属于蒽醌类,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等生物学效应。然而迄今为止,关于大黄素甲醚对Hcy导致的血管损伤的保护作用及机制研究尚未见报道。因此,本实验通过体内外实验,从整体、组织、细胞分子水平,探讨大黄素甲醚对Hcy致血管损伤的保护作用及机制,以期为Hcy致血管损伤的防治提供科学依据。方法1.大黄素甲醚对HHcy大鼠血管功能的保护作用在体实验将正常喂养一周的大鼠随机分为Control组、HHcy组、大黄素甲醚低干预组和大黄素甲醚高干预组。Control组正常进食,HHcy组和大黄素甲醚干预组喂食含甲硫氨酸(3%)的饲料,大黄素甲醚干预组分别灌胃大黄素甲醚30、50 mg/kg,Control组和HHcy组灌胃等量的生理盐水。采用离体血管环实验装置和BL-420E+生物机能实验系统观测乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)对苯肾上腺素预收缩的大鼠离体主动脉环的舒张效应的影响。用酶标仪检测大鼠血浆中Hcy、NO、SOD和MDA水平。2.大黄素甲醚对Hcy致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用选用体外培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),建立HUVECs的Hcy损伤细胞模型。将HUV ECs分为Control组、Hcy组、大黄素甲醚干预组,进行如下的实验:(1)MTT法测定Hcy对HUVECs细胞存活率的影响,并测定不同浓度大黄素甲醚预孵育后,Hcy对HUVECs细胞存活率的影响;(2)Hoechst 33342染色法测定大黄素甲醚预孵育后,Hcy对HUVECs细胞凋亡的影响;(3)采用流式细胞技术检测Hcy对HUVECs细胞凋亡的影响,并检测不同浓度大黄素甲醚预孵育后,Hcy对HUVECs细胞凋亡的影响。3.大黄素甲醚对Hcy致HUVECs损伤的保护作用的分子机制按照上述分组继续进行如下实验(1)用荧光探针DCFH-DA将HUVECs标记后,应用流式细胞技术分析细胞中ROS水平;(2)用荧光探针JC-1将HUVECs标记后,应用流式细胞技术检测细胞的荧光强度,分析细胞的线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP);(3)应用硝酸还原酶法检测细胞上清液中NO水平;(4)采用Western blot法,观测HUECs中eNOS和Akt蛋白表达,同时观测Bcl-2、Bax和Caspase-3、Caspase-9等凋亡蛋白表达;(5)用荧光探针Fluo-3将HUVECs标记后,用荧光显微镜检测细胞内钙离子水平。结果1.大黄素甲醚对HHcy大鼠血管功能的保护作用血管张力实验显示,与Control组相比,内皮依赖性舒张因子ACh对HHcy大鼠的主动脉环舒张效应显著减弱;与HHcy组相比,大黄素甲醚干预组ACh的舒张效应显著提高。说明大黄素甲醚对Hcy诱导的血管内皮损伤起保护作用。血浆中Hcy、NO、SOD、MDA检测显示,与Control组相比,HHcy组大鼠血浆中Hcy和MDA水平显著升高,而NO和SOD水平显著下降;与HHcy组相比,大黄素甲醚干预组大鼠血浆上述指标被显著逆转。结果表明,HHcy大鼠造模成功,且大黄素甲醚能抑制HHcy大鼠血浆中氧化应激水平升高和NO水平的降低,发挥其保护作用。2.大黄素甲醚对Hcy致HUVECs损伤的保护作用MTT显示,与Control组相比,Hcy组HUVECs的存活率显著降低;而与Hcy组相比,大黄素甲醚干预组剂量依赖地抑制Hcy诱导的HUVECs存活率的降低。凋亡相关实验显示,与Control组相比,Hcy组HUVECs凋亡显著增加;而与Hcy组相比,大黄素甲醚干预组剂量依赖地抑制Hcy诱导的细胞凋亡。说明大黄素甲醚能保护Hcy诱导的HUVECs损伤。3.大黄素甲醚保护Hcy致HUVECs损伤的分子机制ROS检测显示,与Control组相比,Hcy组HUVECs内ROS水平显著升高;而与Hcy组相比,大黄素甲醚干预组剂量依赖地抑制Hcy的作用。说明大黄素甲醚通过降低胞内ROS产生,发挥其对Hcy致HUVECs损伤的保护作用。MMP检测显示,与Control组相比,Hcy组HUVECs内线粒体膜显著去极化,表现为红色荧光强度减弱;而与Hcy组相比,大黄素甲醚干预组剂量依赖地抑制Hcy的作用。说明大黄素甲醚通过抑制Hcy诱导的线粒体膜去极化,发挥对Hcy致HUVECs损伤的保护作用。与Control组相比,Hcy组HUVECs内钙离子的水平显著降低,同时p-Akt/Akt和p-eNOS/eNOS的表达均下调,NO的生成显著降低;与Hcy组相比,大黄素甲醚干预组HUVECs内Hcy诱导的上述变化减弱;大黄素甲醚升高钙离子和NO水平的作用在钙池操纵的钙通道抑制剂2-APB存在下显著减弱,大黄素甲醚升高NO浓度的作用也能被PI3k/Akt抑制剂WT阻断。说明大黄素甲醚通过Ca2+-eNOS-NO信号途径发挥对Hcy致HUVECs损伤的保护作用。与Control组相比,Hcy组HUVECs内线粒体膜电位和Bcl-2/Bax蛋白的比值显著下降,而Caspase-3和Caspase-9及其剪切蛋白的表达增加;与Hcy组相比,大黄素甲醚干预组HUVECs内Hcy诱导的上述变化得到改善。说明大黄素甲醚通过抗凋亡相关信号途径发挥其对Hcy致HUVECs损伤的保护作用。结论大黄素甲醚通过PI3K/Akt和Ca2+-eNOS-NO信号途径,减轻氧化应激和抑制细胞凋亡,从而发挥其对Hcy致血管损伤的保护作用。