番茄青枯病抗性基因的定位与克隆

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植物细菌性枯萎病(Bacterial wilt)俗称青枯病,是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F Smith)引起的一种严重制约作物生产的土传病害。青枯菌的寄主范围极其广泛,不同地理起源的青枯菌在与其寄主协同进化过程中又演化出更多的菌系。因而青枯菌的形态特征、种下分化、致病性极其复杂,采用传统方法阐明其致病及抗病机制十分困难。随着基因组与转录组等技术的发展,从全基因组水平鉴定抗病基因并研究抗病机制已经成为可能。本论文在建立准确的番茄青枯病抗性接种鉴定方法并鉴定了青枯病抗病材料基础上,利用抗病高代自交系‘ZRS7’和感病高代自交系‘HTY9’为亲本材料,杂交后构建F2分离群体;利用BSA-Seq对青枯病抗病基因进行遗传定位,筛选候选基因;通过抗、感病亲本植株接种前后的转录组分析进一步挖掘和验证抗性基因;最后利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术对候选基因进行初步功能分析,为青枯病抗性新基因鉴定与利用提供研究基础。获得主要结果如下:1.采用浸根接种法对不同杂交组合的番茄材料进行青枯病接种鉴定,选出抗感性状非常稳定,且不易受环境影响的一组番茄材料,即抗感病自交系‘ZRS7’,感病自交系‘HTY9’。采用4种不同的接种方法对‘HTY9’番茄材料进行接种鉴定发现,各接种方法均能使感病材料发病,但接种致病率不同,表现为茎干接种法>浸根接种法>伤根灌注法>灌根接种法。由于伤根灌注法操作简单,接种鉴定效果稳定,故其可作为优先选择的鉴定方法。2.利用浸根接种法对F2代分离群体各单株进行抗病性鉴定,筛选出的极端抗病池和极端感病池,连同亲本‘ZRS7’与‘HTY9’进行重测序与SNP分析,结果共获得136 Gbp clean reads,两亲本平均测序深度为20.1×,两个混合池测序深度为56.24×;共检测到1672851个SNP位点与247412个InDel位点。经ΔSNP-index方法计算共检测到3个与番茄青枯病抗性相关的重要区间,分别位于2号、7号和12号染色体上,物理距离分别为43-52Mb,59-60 Mb,0-62 Mb。根据亲本间序列差异,在关联区间及其邻近位置的变异位点处分离的SNP分析结果,共筛选出19个候选基因。3.利用番茄抗病株系‘ZRS7’和感病株系‘HTY9’接种青枯菌后3 d后茎组织的转录组测序分析,GO功能分析发现在分子功能上与抗病性状相关的途径主要富集在钙调蛋白、受体等蛋白以及阳离子、金属离子等离子的结合功能上;KEGG分析发现抗、感病植株的差异表达基因主要富集在次生代谢物的合成、植物病原互作、木质素的合成和苯丙氨酸代谢等过程中。通过BSA-Seq分析筛选的19个候选基因有12个在转录组分析中差异表达,其中Solyc12g006270、Solyc12g005380、Solyc12g005080、Solyc12g006380等4个基因表达差异显著;qRT-PCR进一步证实Solyc12g005080与Solyc12g006380接种3天后在抗病与感病亲本中均显著上调表达,而Solyc12g006990仅在感病亲本中变化显著。4.利用转基因病毒沉默体系(VIGS)在抗病植株‘ZRS7’中沉默Solyc12g005080和Solyc12g006990两个基因。Solyc12g005080基因沉默植株出现明显的感病症状,GO注释显示Solyc12g005080参与可减缓病原物的繁殖速度的次生代谢物的合成,而PAL是次生代谢物合成过程中的关键酶,生理指标测定结果显示Solyc12g005080基因沉默植株接种青枯菌后PAL活性显著低于对照,据此可推测Solyc12g005080基因可能通过参与合成抗病相关的次生代谢物质来限制青枯菌在植株内的增殖,从而抵御青枯病。所以该基因在植物抗病过程中起着至关重要的作用。Solyc12g006990基因沉默植株虽然未出现抗病性的明显变化,但观察其茎切面及其去除表皮茎干发现,与对照相比入侵的细菌数增多,说明该基因在番茄青枯菌侵染过程中也发挥一定的作用。
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