背景和目的蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是一种高病死率和持久性的全球健康难题。虽然诱发SAH的因素有多种,但脑动脉瘤破裂引发的SAH占SAH总数的75%-85%。SAH出血后,可能引起患者出现嗜睡、混乱、局灶性神经功能缺损、偏瘫,甚至昏迷等,严重威胁患者健康和生活质量。从病理机制方面研究SAH并发症的发生机制,将有益于SAH病发后患者的治疗和预后。SAH发生后引起机体神经功能缺损往往诱发一些大脑病理机制的发生,如脑积水、内皮细胞和神经细胞凋亡、大脑水肿、血脑屏障消失、大脑调节机制异常、血栓形成等等。其中脑水肿和脑积水的发生对神经功能损伤造成了深远的影响。在脑水肿和脑积水发生过程中,水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)的作用至关重要。AQP1和AQP4是中枢神经系统中最主要的两种水通道蛋白。已有研究表明AQP1或者AQP4与肿瘤性脑水肿、脑创伤、中风及AQP4基因敲除引发脑积水有一定关联性。但已有的研究表明,AQPs的表达可能在脑积水的形成过程中起到一种反馈和代偿机制,且大多都是基于AQP4基因敲除大鼠或者先天性脑积水、诱发的脑积水模型进行研究而得出的结论。而基于正常小鼠(未进行AQP1、AQP4基因敲除)SAH后水通道蛋白的动态变化以及水通道蛋白与脑积水关系,国内外目前无相关报道;而且亦少有文献报道SAH引起脑水肿的病理生理与水通道蛋白的关系。另外,在各种生理或者病理生理条件下,AQP1和AQP4蛋白水平的变化是可以被调控的。虽然证据指出多种机制参与AQP1和AQP4表达水平的调控过程,但具体的调节机制尚未完全明确。细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)包括ERK1和ERK2,是属于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路中的一个通路,其磷酸化活化状态在调控脑损伤、星形胶质细胞膨胀、脑血屏障损伤等过程中发挥重要作用。而且,在其它神经细胞中,ERK1/2信号通路的激活与AQP1或者AQP4的表达存在一定关系。然而,ERK1/2调控AQP1或者AQP4是否参与SAH引发脑水肿的过程尚未可知。因此,本课题将通过建立正常小鼠的SAH模型,探讨脑水肿和脑积水形成过程中,AQP1和AQP4的动态表达变化。并通过阻断ERK1/2信号通路,探讨ERK1/2对AQP1、AQP4表达的调控及其对SAH并发性病理状态的影响。第一部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后急性期脑水肿中的作用材料与方法1.实验分组及模型建立:体质量为28-32 g的雄性健康昆明小鼠按随机数字表法分为正常对照组、假手术组和SAH手术组(SAH组),SAH组又分为术后8h、16h、24h和3d四个亚组。采用自体血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型,正常对照组小鼠经相同的手术过程,但未作任何处理;假手术组小鼠也经相同的手术过程,但不注入自体血,而是注入等渗生理盐水。2.检测指标及方法:每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,然后利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过伊文思蓝(EB)溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;在每组各8只小鼠额部脑皮质和额角脉络丛、矢状窦处提取标本,通过荧光定量PCR和Western Blot检测脑皮质和室周中AQP4表达以及脉络丛和室周中AQP1表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.与Sham组相比,SAH急性期术后不同时间点(8h、16h、24h和3d)组小鼠均出现神经功能受损,且在术后8 h时受损最严重,随着时间的延长,神经功能逐渐恢复,但仍低于Sham组;SAH小鼠脑组织含水量和血脑屏障通透性在术后不同时间点(8h、16h、24h和3d)均较Sham组显著升高(P<0.05),且在术后24h达到峰值,术后3 d较术后24 h相比,脑组织含水量和血脑屏障通透性均下降。2.Real-time PCR和western blot结果显示SAH急性期术后不同时间点(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠皮质和室周AQP4 m RNA和蛋白表达水平分别较Sham组小鼠上调,且术后8 h、16 h和24 h小鼠皮质和室周AQP4表达量逐渐升高,在术后24 h达到峰值,术后3 d较术后24 h相比,皮质和室周AQP4表达量均下调。3.Real-time PCR结果显示SAH急性期术后不同时间点(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠脉络丛AQP1 m RNA表达水平较Sham组下调,术后8 h、16 h和24 h脉络丛AQP1 m RNA表达量逐渐下调,在术后24 h降至最低值,术后3 d较术后24 h相比,脉络丛AQP1 m RNA表达量上调;western blot结果提示术后8 h、16 h和24 h小鼠脉络丛AQP1蛋白表达较Sham组略有下降。SAH术后不同时间点(8 h、16 h、24 h和3 d)小鼠室周AQP1 m RNA和蛋白表达量较Sham组均上调,且随着时间的增加,于术后24 h达到最高峰,术后3 d较术后24 h小鼠相比,室周AQP1表达下调。第二部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后慢性期脑积水中的作用材料与方法1.实验分组及模型建立:将SAH小鼠分为无脑积水组和脑积水组,两组小鼠又进一步细分为术后1周、2周和4周各3个亚组。采用自体血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型。2.检测指标及方法:每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,并利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过EB溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;在每组各8只小鼠额部脑皮质和额角脉络丛、矢状窦处提取标本,通过荧光定量PCR和Western Blot检测脑皮质和室周中AQP4表达以及脉络丛和室周中AQP1表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.SAH慢性期术后不同时间点(1周、2周和4周)相比,无脑积水组和脑积水组小鼠神经功能均无统计学差异(P>0.05),随着时间的增加,无脑积水组小鼠脑组织含水量和血脑屏障通透性没有变化,而脑积水组脑组织含水量和血脑屏障通透性均逐渐增加;脑积水组与非脑积水组相比,不同时间点(1周、2周和4周)小鼠神经功能均显著下降(P<0.05)而脑含水量均显著升高(P<0.05),术后1周两组小鼠血脑屏障通透性无显著差异(P>0.05),术后2周和4周脑积水组小鼠血脑屏障通透性较非脑积水组显著增加(P<0.05)。2.Real-time PCR结果显示无脑积水组小鼠室周和皮质AQP4 m RNA表达在SAH慢性期术后不同时间点(1周、2周和4周)无差异,而脑积水组随着术后时间的增加,AQP4 m RNA表达逐渐上调;脑积水组与非脑积水组相比,术后1周小鼠室周和皮质AQP4 m RNA表达无显著差异(P>0.05),术后2周和4周表达均显著增加(P<0.05)。Western blot结果显示术后1周和2周,小鼠室周AQP4蛋白表达在脑积水组与非脑积水组中均无差异,而皮质AQP4蛋白表达在脑积水组中略有下降,术后4周,小鼠室周和皮质AQP4蛋白在脑积水组中较非脑积水组中均显著上调(P<0.05)。3.Real-time PCR结果显示无脑积水组小鼠脉络丛和室周AQP1 m RNA表达在SAH术后不同时间点(1周、2周和4周)的差异无统计学意义(P>0.05),而脑积水组中,随着术后时间的增加AQP1 m RNA表达也增加;脑积水组与非脑积水组相比,术后1周和2周时,小鼠脉络丛和室周AQP1 m RNA表达下调,术后4周AQP1 m RNA表达显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示术后1周脑积水组小鼠脉络丛和室周AQP1蛋白表达较无脑积水组均下调,脉络丛AQP1蛋白在术后2周和4周表达无差异,室周区域在术后2周表达无差异,术后4周在脑积水组表达上调。第三部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后不同程度脑积水中的作用材料与方法1.实验分组及模型建立:将SAH术后4周的小鼠根据核磁共振(MRI)结果分为轻度、中度、重度脑积水组。采用自体血注入枕大池的方法建立SAH小鼠模型。同等数量的无脑积水SAH小鼠为对照。2.检测指标及方法:MRI检测脑室大小及脑积水的程度;每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,及利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过EB溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;在每组各8只小鼠额部脑皮质和额角脉络丛、矢状窦处提取标本,通过荧光定量PCR和Western Blot检测脑皮质和室周中AQP4表达以及脉络丛和室周中AQP1表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.根据小鼠侧脑室/脑组织宽度比值将SAH脑积水小鼠分为轻度、中度和重度三个组。与对照组相比,SAH不同程度脑积水小鼠神经功能均显著下降(P<0.05)、脑含水量和血脑屏障通透性均显著增加(P<0.05),且随着脑积水严重程度的增加,神经功能逐渐下降、脑含水量和血脑屏障通透性逐渐上升。2.Real-time PCR和western blot结果显示SAH不同程度脑积水组与对照组相比,小鼠室周和皮质AQP4 m RNA和蛋白表达水平均上调,且随着脑积水严重程度的增加,AQP4 m RNA和蛋白表达逐渐增加。3.Real-time PCR和western blot结果显示SAH不同程度脑积水组与对照组相比,小鼠脉络丛和室周AQP1 m RNA和蛋白表达水平均上调,且随着脑积水严重程度的增加,AQP1 m RNA和蛋白表达逐渐增加。第四部分AQP4和AQP1在蛛网膜下腔出血后急性期的可能机制材料和方法1.实验分组:小鼠分为假手术组、SAH+U0126组和SAH+vehicle组。SAH+U0126组是于SAH处理后脑池注射ERK通路阻断剂U0126(U0126溶于0.1%DMSO中,并以0.20μg/Kg体质量对小鼠进行脑池注射),于SAH后8 h,16 h,24 h连续给药,并于SAH后3 d对小鼠进行神经行为学评分、脑含水量、血脑屏障和相关蛋白等进行检测。SAH+vehicle组小鼠处理时间与SAH+U0126组相同,只是注射0.1%DMSO(溶于生理盐水)。2.检测指标及方法:每组各8只小鼠麻醉醒后,对其进行神经功能评分,并利用干湿法测定小鼠脑组织水含量;通过EB溶液对每组各8只小鼠血脑屏障的通透性进行血脑屏障通透性测定;Western Blot检测每组各8只小鼠室周中ERK、AQP1、AQP4的表达。3.统计分析:采用SPSS 13.0统计学软件分析。所有数据均以均数±SD的形式表示。组间比较用单因素方差分析,各组均数间比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.Western blot结果显示小鼠室周p ERK蛋白表达在SAH术后不同时间点(8h、16h、24h和3d)较Sham组均显著上调(P<0.05),且随着术后时间的增加,于术后24h达到表达最高峰,术后3d与24h相比,室周区域p ERK蛋白表达下调。Peason相关性分析显示SAH术后小鼠室周p ERK分别和AQP1及AQP4蛋白表达呈显著正相关(r=0.384,P<0.05;r=0.749,P<0.05)。2.Western blot结果显示,SAH组小鼠室周p ERK、AQP1和AQP4蛋白较未注射组小鼠均显著增加(P<0.05),SAH小鼠术后8h、16h和24h连续脑池注射ERK抑制剂U0126后,室周AQP1和AQP4蛋白表达显著降低(P<0.05)。3.与Sham组相比,SAH组小鼠神经功能显著下降(P<0.05)、血脑屏障通透性和脑组织含水量均显著增加(P<0.05),SAH小鼠术后8h、16h和24h连续脑池注射ERK抑制剂U0126后,神经功能显著上升(P<0.05)、血脑屏障通透性和脑组织含水量均显著降低(P<0.05)。结论1.枕大池二次注血法建立SAH模型小鼠,SAH急性期(术后8h、16h、24h和3d)均出现脑损伤,且在术后24h损伤最严重;SAH慢性期(术后1周、2周和4周)脑积水组小鼠较无脑积水组脑损伤严重,脑积水小鼠在SAH术后4周损伤最严重。2.SAH急性期小鼠在术后24h时皮质和室周AQP4表达水平最高,脉络丛和室周AQP1表达水平在术后24h时分别最低和最高;SAH慢性期脑积水小鼠较无脑积水小鼠室周和皮质AQP4表达从术后2周开始上调,脉络丛和室周AQP1表达从术后4周开始上调;SAH小鼠AQP4和AQP1表达随着脑积水严重程度的增加而增加。3.SAH急性期小鼠室周p ERK蛋白表达分别与AQP1和AQP4蛋白表达呈显著正相关。ERK抑制剂U0126可显著下调SAH小鼠室周AQP1和AQP4蛋白的表达。