花生是世界重要的油料作物和经济作物,特别在广大发展中国家,是重要的食用植物油和食用蛋白源。温度是影响花生生长发育,限制花生种植地理分布的重要因素之一。筛选耐低温花生种质,并分离耐低温相关基因对于培育高产稳产的耐低温型花生品种,进一步提高花生单产,扩大花生种植面积,具有十分重要的意义。本研究首先利用55份花生种子进行低温吸胀萌发试验,统计露白率及芽长/种长,筛选耐低温种质,并通过近红外光谱技术测定油酸、亚油酸、棕榈酸、脂肪、蛋白质及蔗糖含量,分析花生种子吸胀期间耐低温性与各项品质性状之间的相关性。结果表明:参试花生种质在低温胁迫条件下,露白率≥80%的种质有3份、80%>露白率≥70%的种质有3份、70%>露白率≥60%的种质有5份、露白率<60%的种质有43份(占总数78.18%);芽长/种长>0.5的种质有3份、0.5>芽长/种长>0.4的种质有5份、0.4>芽长/种长>0.3的种质有3份、芽长/种长<0.3的种质有43份。其中,多粒型种质A4的耐低温性最强,露白率为95%、芽长/种长为1.50。种子的露白率与芽长/种长呈极显著正相关、与脂肪含量呈显著正相关,芽长/种长与亚油酸含量呈显著正相关、与油酸含量呈显著负相关,但这两项指标与百仁重相关性均不显著。将耐低温性最强的花生种质A4,分别进行2℃吸胀处理和田间正常播种时的温度15℃进行吸胀处理,取吸胀1h,6h和24h的花生样品,提取花生种子的总RNA,并分离与纯化mRNA,采用PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit构建3个低温胁迫下的抑制差减杂交文库(SSH cDNA文库),分别标记为A库、B库和C库。3个文库分别随机挑选500个克隆进行测序,成功测序的条数分别为336,429和466。经序列组装,A库获得8个unigenes,其中7个contig和1个singlet;B库获得18个unigenes,其中14个contig和4个singlet;C库获得193个unigenes,其中73个contig和120个singlet。通过BLAST2GO软件与GenBank中的非冗余蛋白数据库(non-redundant protein database)进行比对和功能注释,其中,A库7个unigene有相关同源信息,B库14个unigene有相关同源信息,C库132个unigene有相关同源信息。基因功能主要涉及到转录调控、能量代谢、胁迫防御、细胞结构、细胞保护、信号转导和生物合成等方面。从3个文库中获得的重组克隆中,根据比对和注释的结果,挑选了14个感兴趣的基因,验证其在正常温度处理下和低温胁迫处理下,基因的差异表达情况。用荧光实时定量PCR的方法进行验证,采用2-ΔΔCt的方法,每个反应重复3次取平均值。经验证,这14个基因在2℃低温胁迫处理条件下的表达量是对照处理15℃情况下的2.85-12.85倍不等。选取4个经验证确实与植物耐低温相关的基因,利用RACE的方法获得全长序列,它们是LEA(胚胎发育晚期丰富蛋白)基因、Oleosin(油质蛋白)基因、NAC转录因子以及MYB转录因子。其中,MYB基因是首次在花生上分离出来。经序列分析发现,本实验中所克隆LEA序列长度为1526bp,编码155个氨基酸;Oleosin序列长度为760bp,编码176个氨基酸;NAC序列长度为1406bp,编码301个氨基酸;MYB序列长度为1365bp,编码344个氨基酸。并用生物信息学软件分别预测了其编码蛋白的物理化学性质,功能结构域,活性位点以及二级、三级结构。这些工作为通过gene knock-in和gene knock-out方法对这些基因进行功能分析乃至通过分子育种手段培育花生耐低温品种奠定基础。