论文部分内容阅读
继2000年6月人类基因组框架图绘制完成后,2001年2月研究者又宣布人类基因组共有32亿个碱基对,约3.4万个蛋白编码基因,其数字远远低于最初预计的14万个基因。这给我国的基因组研究带来了更大的压力,只有加快研究速度,努力发现新基因,深入研究和探讨新分子的生物学功能以及对疾病诊断、治疗的意义,我们才能挤身世界生物科学研究的前沿,形成具有我国自己知识产权的学术特色。 树突状细胞(Dendritic cells,DC)是人体内重要的抗原提呈细胞,本研究所对DC的分化发育及其介导的肿瘤免疫治疗的研究工作己进行多年,并在此基础上建立了人树突状细胞基因文库,通过大规模随机测序的方法开展了从DC中克隆新分子的工作,从2万余条EST中发现了许多新的分子。在本课题中,我们选择其中4个进行了克隆表达和生物学功能研究。 鸟昔酸还原酶(guanosine monophosphate reductase,GMPR)(EC 1.6.6.8)主要催化鸟嗓吟核苷酸(GMP)向次黄嘌呤核苷酸(IMP)的转化:GMP+NADPH+2H+→IMP+NH4+NADP+。该酶所催化的反应对维持细胞内腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的平衡发挥着重要作用。细胞内鸟嘌呤核苷酸池的含量与前髓性白血病HL-60细胞的分化密切相关。我们从人树突状细胞cDNA文库中分离到一个新的全长cDNA,编码一个由348个氨基酸组成的未知蛋白。该蛋白质与人鸟苷酸还原酶在氨基酸水平上有高达79%的同源性,并暂时命名为GMPR2。Northern杂交分析显示新分子的mRNA广泛表达于正常人体组织及多数肿瘤细胞系。将构建的真核表达载体pcDNA3.1-GMPR2用脂质体法转染COS7细胞,经瞬时表达获得myc-His融合的重组新分子蛋白。通过生物化学方法,我们证实新分子蛋白具有催化鸟苷酸还原的酶学活性。用同样的方法将pcDNA3.1-GMPR2转染HL-60细胞,证实其经佛波脂(TPA)诱导向单核细胞的分化作用明显增强。因此,通过本课题的研究我们发现了一个新的人鸟苷酸还原酶分子,并且该分子与HL-60白血病细胞的分化密切相关。 6-磷酸葡萄糖胺异构酶(glucosamine-6-phosphate isomerase,GMII)又名 6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶(glucosamine-6-phosphate deaminase,GMPDA)(EC 5.3.1.10),主要催化6-磷酸葡萄糖胺分解生成果糖和氨。该反应是N-乙酚-6-磷酸葡萄糖胺分解代谢 二博」:学位论文 Molecular cloning and characterlzatlon ofnovel proteins derived from human dendrltlc cells.途径的最后一步,包括6-磷酸葡萄糖胺的醛酮异构和加氨或脱氨过程。人GNPI的生物学功能尚不明确。有研究者从仓鼠的精细胞中克隆纯化到一种可溶性蛋白*scillin),该蛋白经微注射入小鼠卵细胞内可诱发钙离子浓度的震荡,这一变化与卵细胞受精时所发生的变化相同。而Oscillin在氨基酸水平上与细菌的GNPI有高达53%的同源性。从人树突状细胞基因文库中我们分离到一个新的全长CDNA克隆,编码一个由276个氨基酸组成的未知蛋白。该蛋白质与人个磷酸葡萄糖胺异构酶和Oscillin在氨基酸水平上均有高达87%的同源性,暂时命名为GamIZ。Northern 杂交分析显示新分子的znRNA广泛表达于正常人体组织及多数肿瘤细胞系。其组织表达谱与GNPI不同。通过与前一分子相同的技术路线,我们表达了GWIZ的重组蛋白,并通过生化法证实该新分子重组蛋白具有催化6-磷酸葡萄糖胺分解生成果糖的酶学活性。因此,我们认为该新分子是一个新的人卜磷酸葡萄糖胺异构酶,可能是与GNPI分布在不同组织和肿瘤细胞,并发挥相同催化作用的同功酶。 脂肪酸在线粒体内的p氧化是细胞能量的主要来源。脂肪酚辅酶A脱氢酶归cyl-coe…e A dehydrogenase,ACDs)主要催化脂肪酸在线粒体内p氧化的第一步,是脂肪酸氧化的限速酶。特长链酚辅酶 A脱氢酶WLCAD*EC.3.99.13)主要催化含 1420个碳原子的特长链酚辅酶A的氧化。由于长链脂肪酸是人类心脏、肝脏、骨骼肌等组织的主要能源,因此,VLCAD的缺陷常导致严重的新生儿原发性心肌病kardiomyopathyX 不明原因的新生儿碎死、低酮性低血糖、肝功能衰竭等。我们从人树突状细胞基因文库中分离出一个新的ACDS家族的同源基因,暂时命名为ACAD习。该基因包含一个 1866 hp的完整阅读框,共编码 621个氨基酸。ACAD习与VLCAD有65%的同源性。ACAD-9的W优势表达于人的心脏,骨骼肌、脑、肾脏及肝脏等组织。通过生化方法证实ACAD-9可以催化软脂酚辅酶A和硬脂酚辅酶A的p氧化。我们推测,ACAD习是ACDS家族的一个新成员,该基因的突变可能与新生儿碎死及原发性心肌病的发病密切相关。 细胞死亡有两种不同的机制,坏死和凋亡。它们在细胞形态学和生物化学上有着明确的区分标准。TNF-0既可以诱导小鼠成纤维肉瘤L929细胞发生坏死,也可以诱导其发生凋亡。据推测,两种不同细胞死亡方式可能分别山不同的TNF抵抗蛋白进厅调节。我们分离出一个新的CDNA克隆,它?