背景:小檗碱(Berberine,BBR)是一种从天然药物中提取的异喹啉类生物碱,常用于胃肠道疾病的治疗。近年的研究证实其可通过增加LDL-C受体的表达,激活AMP激酶和阻断MAPK/ERK通路来降低低密度脂蛋白和甘油三脂的水平。他汀类药物主要通过抑制甲羟戊酸的合成,减少胆固醇在肝脏的合成而降低低密度脂蛋白水平,是临床常用的调血脂药。基于BBR与他汀类药物调血脂作用机制的不同,临床上常将BBR与他汀类药联合应用于高脂血症的治疗。但有报道他汀类药物引发的横纹肌溶解副作用,60%是因联合用药改变代谢或转运特性所致,故而BBR对药物代谢酶和转运体的影响备受学者关注。研究发现,BBR及其(40)相代谢产物小檗红碱(Berberrubine,BRB)、去亚甲基小檗碱(Demethylene berberine,DBB)在肝脏中浓度远高于血浆中浓度,且可影响药物的代谢酶和转运体功能,然BBR与他汀类药物联合应用后,是否因其对药物代谢酶和转运体的作用导致药物相互作用的发生尚属未知,确应系统探究。值得一提的是,诸多研究表明,核受体在调控药物代谢和转运相关的靶基因方面发挥着至关重要的作用,BBR亦通过激活肝X受体α(liver X receptor alpha,LXRα),增加巨噬细胞中ABCA1转运体的表达,降低细胞中胆固醇的堆积并减少泡沫细胞的形成。然而,围绕核受体-代谢酶/转运体的通路,BBR对调血脂药的代谢和转运到底有何影响迄今亦无研究报告。因此,对BBR在核受体-CYP450/OATPs通路上的作用展开深入系统研究,可为BBR与他汀类药物合理联用提供科学依据。本课题旨在通过Hep G2细胞模型考察BBR及其代谢产物BRB、DBB对CYP450酶和OATP1B1转运体表达及代谢转运他汀类药物的影响;并在大鼠模型中研究长期给予BBR后对阿托伐他汀和瑞舒伐他汀药代动力学过程,分析药动学特征改变与代谢酶和转运体活性的关联;最后,在Hep G2细胞模型上,通过RT-q PCR、Western-blot和双荧光素素酶报告基因及RNA干扰等分子生物学技术,探究BBR在核受体-CYP450/OATPs通路上的调控作用及分子学机制。目的:1.系统研究在Hep G2细胞中BBR、BRB和DBB对CYP1A2、3A4、2B6m RNA、蛋白表达及酶代谢底物活性的影响。2.系统研究在Hep G2细胞中BBR、BRB和DBB对OATP1B1 m RNA、蛋白表达及转运阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的影响。3.运用SD大鼠模型,研究长期给予BBR对调血脂药物阿托伐他汀和瑞舒伐他汀药代动力学特征的影响;探讨该影响与代谢酶、转运体之间的关联性。4.基于核受体Ah R、PXR和RXRα调控通路研究BBR及BRB调控代谢酶CYP1A2、3A4和转运体OATP1B1的作用,揭示BBR及BRB在Ah R、PXR和RXRα-CYP450/OATP1B1通路上作用的分子学机制。方法:1.运用RT-q PCR实验技术,研究BBR、BRB和DBB对Hep G2细胞中CYP1A2、3A4、2B6和OATP1B1 m RNA表达的影响。2.运用Western blot实验技术,研究BBR和BRB对Hep G2细胞中CYP1A2、3A4、2B6、OATP1B1和核受体Ah R、PXR、RXRα、FXR、LXRα蛋白表达的影响。3.建立LC-MS/MS方法,测定非那西汀、咪达唑仑和阿托伐他汀的浓度,分别评价BBR和BRB长期诱导对Hep G2细胞中CYP1A2、3A4酶活性的影响;测定细胞样品和血浆中阿托伐他汀、瑞舒伐他汀的浓度,分别考察BBR和BRB长期诱导对Hep G2细胞摄取阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的影响及大鼠体内长期给予BBR对阿托伐他汀、瑞舒伐他汀药代动力学影响。4.构建p GL3-Ah R-CYP1A2-luc和p GL3-PXR-CYP3A4-luc双荧光素酶报告基因,研究Ah R和PXR在BBR/BRB调控CYP1A2和CYP3A4表达中的作用。构建p GL3-FXR-OATP1B1-luc和p GL3-LXRα-OATP1B1-luc双荧光素酶报告基因,研究RXRα、FXR和LXRα在BBR/BRB调控OATP1B1转运体的作用。5.运用RNA干扰技术构建沉默Ah R和PXR以及RXRα、FXR、LXRα的细胞模型,研究BBR及BRB在Ah R和PXR在调控CYP1A2和CYP3A4通路上的作用;研究BBR及BRB在RXRα、FXR和LXRα调控OATP1B1通路上的作用结果:1.BBR、BRB和DBB对CYP1A2、3A4、2B6的表达及酶代谢底物活性的影响1.1 BBR、BRB促进Hep G2细胞中CYP1A2、3A4 m RNA表达RT-q PCR结果表明,5~50μM BBR和5~60μM BRB均可以浓度依赖性促进CYP1A2 m RNA的表达,EC50分别为11.2μM和14.3μM;15~80μM DBB也可以微弱的诱导CYP1A2 m RNA表达,但和对照组比较,差异无统计意义(P>0.05)。5~50μM BBR和5~60μM BRB均可以浓度依赖性促进CYP3A4m RNA的表达,EC50分别为8.2μM和9.6μM。15~80μM DBB对CYP3A4 m RNA的表达无显著影响(P>0.05)。而5~50μM BBR、5~60μM BRB和15~80μM DBB对CYP1B6 m RNA的表达没有显著诱导作用。1.2 BBR和BRB诱导Hep G2细胞中CYP1A2、3A4蛋白表达Western blot结果表明,阳性对照50μM奥美拉唑可以显著诱导CYP1A2蛋白的表达3.5倍,25、50μM BBR和30、60μM BRB可以诱导CYP1A2蛋白的表达,分别为1.6、2.7、1.4、1.9倍,和空白对照组相比,差异有统计意义(P<0.05)。阳性对照10μM利福平、50μM BBR和60μM BRB作用Hep G2细胞48h后,和空白对照组相比,CYP3A4蛋白表达的诱导倍数分别为3.1、2.5、2.7倍。1.3 BBR和BRB增加Hep G2细胞中CYP1A2、3A4酶活性LC-MS/MS检测结果显示,和空白对照组比较,阳性对照50μM奥美拉唑、50μM BBR和60μM BRB分别可以增加非那西汀的代谢175%、165%和157%。和空白对照组比较,5~50μM浓度的BBR可以增加CYP3A4代谢咪达唑仑和阿托伐他汀的能力,其EC50为分别为9.8μM和48.2μM。5~60μM浓度的BRB促进咪达唑仑和阿托伐他汀代谢的EC50为分别为26.7μM和56.3μM。2.BBR、BRB和DBB对Hep G2细胞中OATP1B1表达及转运功能的影响2.1 BBR、BRB和DBB对Hep G2细胞OATP1B1 m RNA、蛋白表达的影响RT-q PCR结果显示,5~50μM BBR和5~60μM BRB均可以浓度依赖性促进OATP1B1 m RNA的表达,EC50分别为21.4±2.6μM和12.5±1.9μM;而系列浓度的DBB对OATP1B1的m RNA表达差异均无统计意义(P>0.05)。Western blot结果表明,25、50μM BBR作用Hep G2细胞24h后,和空白对照组相比,OATP1B1蛋白表达分别上调1.5、2.3倍;其主要代谢产物BRB在30~60μM均可以上调OATP1B1蛋白的表达,和空白对照组比较,差异有统计意义(P<0.05),60μM BRB可上调OATP1B1蛋白表达3.4倍。而其另外一个主要代谢产物DBB在15~80μM浓度范围内对OATP1B1表达差异均无统计意义(P>0.05)。2.2 BBR和BRB增加Hep G2细胞对阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的摄取本研究建立的测定细胞样品中阿托伐他汀和瑞舒伐他汀浓度的LC-MS/MS方法分别在5~640 nmol/L和2~144 nmol/L标准曲线范围内线性关系良好,精密度和准确度均符合要求。摄取实验结果表明,5~50μM BBR可浓度依赖性增加RSV和ATV在Hep G2细胞中的摄取,其EC50值分别为19.01μM、24.16μM;5~60μM BRB同样可浓度依赖性增加RSV和ATV在Hep G2细胞中的摄取,其EC50值分别为13.95μM和27.59μM。3.在SD大鼠体内研究长期给予BBR对调血脂药物阿托伐他汀和瑞舒伐他汀药代动力学的影响及与代谢酶转运体的相关性长期给予高剂量BBR明显影响调血脂药阿托伐他汀和瑞舒伐他汀在大鼠体内的药代动力学过程。结果显示,300 mg/kg BBR连续给药后,阿托伐他汀在对照组和实验组的最大血药浓度(Cmax)分别为9.04±0.97 ng/m L和6.51±0.45 ng/m L,比对照组降低28%;药时曲线下面积(AUC0-t)分别为40.87±13.91 ng/m L·h和28.72±17.15 ng/m L·h,比对照组降低30%,这可能由于BBR提高OATP1B1对他汀类药的肝摄取量,降低体循环的药量所致。消除半衰期(T1/2)从8.2±2.32h降低至5.5±1.49 h,下降33%,而清除速率(CLz/F)增加140%,显然,这是因为BBR的诱导,加快了CYP3A4代谢阿托伐他汀并缩短其消除过程。与此相似,空白对照组和连续给予300 mg/kg BBR的实验组,瑞舒伐他汀在大鼠血浆中Cmax分别为5.83±0.95μg/m L和3.78±0.13μg/m L,下降35%,AUC0-t分别为36.80±11.91μg/L·h和28.88±11.79μg/L·h,降低21%,原由依然是BBR提高OATP1B1活性所致。但其CLz/F分别为2.86±0.83 L/h和3.08±0.74 L/h,T1/2分别为4.71±1.03 h和4.91±1.28 h,与对照组比较差异无统计意义(P>0.05);提示CYP3A4活性的改变对瑞舒伐他汀代谢无影响,与瑞舒伐他汀几乎不经过CYP450代谢的文献报道相一致。4.基于Ah R/PXR-CYP1A2/3A4通路,研究BBR及BRB调控CYP1A2/CYP3A4的作用机制4.1 BBR及BRB激活Ah R/PXR增加CYP1A2/CYP3A4报告基因活性双荧光素酶报告基因结果显示,与对照组比较,10、25、50μM BBR对p GL3-Ah R-CYP1A2-luc的荧光素酶活性分别上调1.3、2.4和3.4倍;15、30、60μM BRB对p GL3-Ah R-CYP1A2-luc的荧光素酶活性分别上调1.1、1.9和2.4倍。10、25、50μM BBR对p GL3-PXR-CYP3A4-luc的荧光素酶活性分别上调1.2、1.4和2.3倍;15、30、60μM BRB对p GL3-PXR-CYP3A4-luc的荧光素酶活性分别上调1.1、1.3和1.8倍。可见BBR和BRB对p GL3-Ah R-CYP1A2-luc和p GL3-PXR-CYP3A4-luc报告基因活性的诱导倍数呈浓度依赖性。表明BBR、BRB是通过激活Ah R/PXR而增加CYP1A2/CYP3A4报告基因活性。4.2沉默Ah R/PXR降低BBR及BRB对CYP1A2/CYP3A4蛋白表达的诱导在正常Hep G2细胞中,与空白对照组相比,5 n M TCDD、50μM BBR和60μM BRB上调CYP1A2蛋白表达分别为3.5、2.4和1.9倍;运用sh RNA-h Ah R质粒转染沉默h Ah R后,5 n M TCDD、50μM BBR和60μM BRB上调CYP1A2蛋白表达仅为1.2、0.96、0.89倍。在正常Hep G2细胞中,与空白对照组相比,10μM RIF、50μM BBR和60μM BRB上调CYP3A4表达分别为2.7、1.8和2.3倍;运用sh RNA-h PXR质粒转染沉默h PXR后,10μM RIF、50μM BBR和60μM BRB上调CYP3A4表达的倍数仅为0.95、0.92和0.97。可见沉默Ah R/PXR显著降低BBR、BRB对CYP1A2/CYP3A4蛋白表达的诱导作用。结果进一步佐证BBR、BRB对CYP1A2/CYP3A4的诱导作用是通过Ah R/PXR介导。4.3 BBR及BRB诱导Ah R/PXR核易位Western blot分析检测核蛋白表达结果表明,50μM BBR和60μM BRB分别上调Ah R核蛋白2.6和2.5倍;50μM BBR和60μM BRB上调PXR核蛋白3.4和1.9倍,与空白组比较,差异有统计意义(P<0.05)。表明BBR及BRB可促进Ah R/PXR由胞浆向胞核的转移。5.基于RXRα、FXR、LXRα通路,研究BBR及BRB调控OATP1B1的作用机制5.1 BBR及BRB激活RXRα增加OATP1B1报告基因活性双荧光素酶报告基因结果表明,BBR与BRB均可浓度依赖性的诱导p GL3-FXR-OATP1B1-luc与p GL3-LXRα-OATP1B1-luc报告基因活性。通过给予经典抑制剂UVI3003,抑制RXRα活性后,BBR与BRB对报告基因活性显著降低,与不加RXRα抑制剂组比较,差异具有显著意义(P<0.05)。结果提示,RXRα在BBR和BRB对OATP1B1表达调控中发挥了关键作用。5.2沉默FXR、LXRα和RXRα降低BBR及BRB对OATP1B1蛋白表达的诱导Western blot结果显示,与空白对照组比较,50μM BBR可上调OATP1B1的表达量2.1倍,而沉默FXR或LXRα后,其诱导分别下降至1.5、1.4倍,沉默RXRα后,其诱导作用仅为空白对照组的0.94倍。与空白对照组比较,60μM BRB可上调OATP1B1的表达量1.9倍,沉默FXR或LXRα后,其诱导倍数分别下降至1.4、1.2倍,沉默RXRα后,BRB诱导作用仅为空白对照组的0.86倍,与不沉默核受体的实验组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。以上结果进一步提示RXRα是BBR和BRB是调控OATP1B1的上游关键核受体。5.3 BBR及BRB诱导FXR、LXRα和RXRα核易位Western blot分析检测核蛋白结果表明,25、50μM BBR增加FXR核蛋白分别为对照组的1.4、1.6倍,增加LXRα核蛋白分别为对照组的1.3、2.0倍,增加RXRα核蛋白分别为对照组的1.7、1.9倍;30、60μM BRB可增加FXR核蛋白分别为对照组的1.6、1.8倍,增加LXRα核蛋白为分别对照组的1.2、1.5倍,增加RXRα核蛋白分别为对照组的1.4、1.8倍。表明BBR及BRB促进FXR、LXRα和RXRα由胞浆向胞核的转移。结论:1.BBR和BRB呈浓度依赖性的诱导CYP1A2、3A4 m RNA和蛋白表达并增加酶的代谢活性。2.BBR和BRB呈浓度依赖性的增加OATP1B1 m RNA和蛋白的表达,并显著促进Hep G2细胞对阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的摄取。3.连续给予300 mg/kg BBR明显降低调血脂药物阿托伐他汀和瑞舒伐他汀在大鼠血浆中的Cmax和AUC0-t,这与BBR诱导OATP1B1的表达,从而显著提高肝脏对阿托伐他汀或瑞舒伐他汀的摄取量密切相关。同时BBR亦诱导CYP3A4活性,从而加快阿托伐他汀在大鼠体内的代谢,使其T1/2明显缩短。故提示,BBR若与他汀类药联合使用,基于BBR对其分布和代谢的影响,可考虑酌情减少他汀类药的给药剂量,尽可能规避横纹肌溶解等不良反应的发生。4.双荧光素酶报告基因及基因沉默实验结果证明,BBR、BRB对CYP1A2/CYP3A4的诱导作用是通过Ah R/PXR介导;BBR、BRB对OATP1B1的诱导作用是通过RXRα、FXR、LXRα介导。Western blot分析结果表明,BBR及BRB可促进Ah R、PXR、FXR、LXRα和RXRα由胞浆向胞核的转移。5.综上,在Ah R、PXR-CYP450/RXRα-OATP1B1调控通路上,BBR和BRB能够促进Ah R、PXR、FXR、LXRα和RXRα的核易位并激活,显著提高他汀类药的代谢和转运能力,这为小檗碱与他汀类药物正确的联合应用于调血脂治疗提供更多的实验依据;亦为Ah R、PXR、RXRα-CYP450/OATP1B1的调控机制增添新的内容。