论文部分内容阅读
第一部分椎间盘软骨终板细胞凋亡体系中CCN3的检测目的：大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡体系中CCN3的检测。方法：分离并培养大鼠原代软骨终板细胞,用甲苯胺蓝染色鉴定软骨终板细胞。分别用1%胎牛血清(FBS)和10%FBS分别培养软骨终板细胞48h,用DAPI和Annexin V/PI双染色来定性和定量检测细胞凋亡；Western blot检测凋亡相关蛋白Fas、细胞色素C、caspase3、PARP的表达；酶活性试剂盒检测caspase-3,-8,-9酶活性；用RT-PCR检测凋亡体系中CCN3的mRNA的表达。结果：软骨终板细胞可被正常培养,甲苯胺蓝染色示细胞有软骨细胞的特征。低血清组细胞发生形态改变,DAPI染色阳性细胞增多；流式细胞仪检测示凋亡率明显增高(10.06%±0.35% VS 22.3%±0.58%,p<0.05)；低血清可以明显上调Fas蛋白、cytochrome C表达,细胞凋亡途径执行者caspase3的表达含量增加,其下游的切割底物聚ADP核糖聚合酶(PARP)明显升高；caspase-3,-8,-9酶活性明显升高,分别10%FBS组的4倍,3倍和4倍；RT-PCR结果示CCN3的mRNA表达明显增加,为10%FBS组的5倍。结论：低胎牛血清培养法能诱导体外培养的软骨终板细胞发生凋亡,并能促使CCN3的表达上调。第二部分CCN3在软骨终板细胞凋亡体系中的生物学作用目的：探索CCN3对大鼠软骨终板细胞凋亡和基质分泌的影响。方法：分离并培养大鼠原代软骨终板细胞；分别在10%FBS和1%FBS组细胞中加入浓度梯度的rCCN3 (Ong/mL, 100ng/mL,200ng/mL,400ng/mL),继续培养48h后,用Annexin V/PI双染色法定量检测细胞凋亡；两组正常培养的细胞分别加入100ng/mL rCCN3和100ng/mL rCCN2,继续培养48h,分别在24h,48h检测aggrecan、col12的mRNA表达及另一种CCN蛋白mRNA的表达。结果：流式细胞仪结果显示：在10% FBS培养组细胞中,浓度梯度的rCCN3对细胞的凋亡无明显影响,结果差异无统计学意义(P>0.05)；而在1% FBS培养组细胞中,随着rCCN3浓度的增加,细胞凋亡率明显增加,结果差异有统计学意义(P<0.05)。加入外源性的rCCN3,蛋白多糖aggrecan和胶原蛋白Ⅱ的mRNA表达被明显抑制,同时CCN2 mRNA的表达也明显减少。但是,rCCN2可以明显增加蛋白多糖aggrecan和胶原蛋白Ⅱ的mRNA表达,但CCN3mRNA的表达含量却被明显降低。结论：CCN3可以在低血清条件下诱导软骨终板细胞的凋亡；CCN3可以抑制细胞外基质的分泌,而CCN2作用相反。