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研究背景及目的：神经病理性疼痛（Neuropathic Pain，NPP）是外周或中枢躯体感觉神经系统损伤或病变引起的一种顽固性疼痛综合征，以自发性疼痛（Spontaneous pain）、痛觉过敏（Hyperalgesia）和触摸痛（Allodynia）为特点。NPP的发病机制仍未阐明，治疗效果不佳，是目前研究的热点。目前国内外研究普遍认为抑制核因子-κB（NF-κB）的激活可以缓解动物的机械性感觉异常和热痛觉过敏，因此抑制NF-κB的激活是一个有潜力的NPP治疗策略。此外，在胚胎干细胞的自我更新与分化机制研究中，有学者发现Nanog通过与NF-κB家族各蛋白相结合抑制它们的转录活性和促分化能力，从而维持胚胎干细胞的多能性。用Nanog来抑制NF-κB的活性可能是一个有效的治疗NF-κB过度激活所引起的神经系统疾病的方法。我们前期的实验研究已发现转Nanog基因的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的NF-κB表达明显减弱。慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，起到良好的基因治疗效果，具有广阔的应用前景。为探讨Nanog基因对周围神经损伤性NPP的治疗机制和效果，我们构建Nanog基因慢病毒载体质粒，进行慢病毒的包装、浓缩、滴度测定和鉴定，接着通过体外实验研究Nanog基因对脂多糖诱导的小胶质细胞炎症反应的影响，最后进行体内实验观察Nanog基因对大鼠周围神经损伤性神经病理性疼痛模型脊髓突触重塑的影响。材料与方法：双酶切（NheI/BamHI）克隆质粒pUC57-Nanog和慢病毒载体质粒pNL-IRES2-EGFP，胶回收目的基因片段。T4连接酶连接回收的目的片段。转化DH5α大肠杆菌后涂于含抗生素的LB固体培养基平板37℃12-16小时。挑选菌落进行PCR鉴定。鉴定正确的菌落摇菌后进行质粒的小量提取，最后双酶切和测序鉴定。结果：经双酶切和测序鉴定pNL-Nanog-IRES2-EGFP重组质粒构建正确。结论：成功构建大鼠Nanog基因慢病毒重组载体质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP，为研究Nanog基因的功能奠定了基础。材料与方法：将慢病毒载体质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP、包装质粒pHELPER和包膜质粒pVSVG共转染293T细胞，包装生产慢病毒。收集病毒悬液，离心取上清，0.45um滤器过滤，加入含聚乙二醇（PEG）的浓缩试剂，混匀后4℃过夜，离心取沉淀，PBS重悬后分装，-80℃保存。倍比稀释法测定慢病毒滴度。RT-PCR和Western Blot检测Nanog mRNA和蛋白质的表达水平。结果：三质粒pNL-Nanog-IRES2-EGFP、pHELPER和pVSVG共转染293T细胞后成功产生出了慢病毒。病毒原液经浓缩后的功能滴度为2×107TU/mL以上。RT-PCR和Western Blot检测证实慢病毒感染的293T细胞中有Nanog mRNA和蛋白质的表达。结论：包装生产出了高滴度携带Nanog基因的慢病毒，为进一步的体外体内实验打下了基础。材料与方法：无菌条件下分离出生后2-3天Sprague-Dawley（SD）大鼠的大脑皮质，去除脑膜和血管，切碎，胰酶消化，200目滤网过滤，制成细胞悬液后置培养箱中培养，8天后加入盐酸利多卡因进行分离纯化。取3-8代细胞进行体外刺激和干预实验，分为正常对照组、LPS单独刺激组、不同浓度pNL-Nanog-IRES2-EGFP转染（1.0、2.0、3.0）后LPS刺激组。在不同的时间点用MTT检测各组细胞的增值能力，RT-PCR检测各组细胞β-actin、Nanog、IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA的表达水平， ELISA检测各组细胞IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白的表达水平。结果：Nanog和LPS对小胶质细胞的生长状态没有明显影响。Nanog可以降低LPS诱导的小胶质细胞IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA和蛋白的表达水平。结论：体外实验证实Nanog可以阻止LPS诱导的小胶质细胞促炎症因子的释放，减弱细胞的炎症反应，具有抗炎作用。材料与方法：雄性SD大鼠40只，4-5月龄，体重180-200克，随机分为5组即假手术组、双侧压迫性坐骨神经损伤（bCCI）组、bCCI+生理盐水组、bCCI+LV-EGFP组和bCCI+LV-Nanog-EGFP组，每组8只。bCCI术后第1天，分别向bCCI+生理盐水组、bCCI+LV-EGFP组和bCCI+LV-Nanog-EGFP组大鼠L4-L6脊髓节段双侧分别直接注射2μL生理盐水、LV-EGFP和LV-Nanog-EGFP。术前及术后每隔3天进行机械痛阈、热痛阈和冷痛阈的测定。术后第90天处死大鼠，取脊髓，制作切片。荧光显微镜下观察脊髓背角绿荧光蛋白的表达情况，甲苯胺蓝染色观察神经元的数量，免疫组织化学染色观察突触素（Syn）、P65、Mu阿片受体（MOR）和胆囊收缩素8（CCK-8）的表达水平，体视学影像系统分析突触数量的变化及其与神经元的比例。结果：与假手术组相比bCCI组于术后第4天起机械痛阈值、热痛阈值、冷痛阈值开始下降，三者分别于术后第16、13、21天降至最低（P<0.05），机械痛阈值和热痛阈值分别于45和33天回到基线，而冷痛阈值持续到术后第90天仍远离基线。bCCI+生理盐水组、bCCI+LV-EGFP组与bCCI组相比痛阈无显著改善（P>0.05）。bCCI+LV-Nanog-EGFP组与bCCI组相比痛阈显著改善（P<0.05）。甲苯胺蓝染色染色显示各组脊髓背角神经元数量无明显差异（P>0.05）。免疫组织化学染色显示与假手术组相比bCCI组、bCCI+生理盐水组、bCCI+LV-EGFP组Syn、P65表达明显增加（P<0.05），MOR、CCK-8表达明显下降（P<0.05）；bCCI+生理盐水组、 bCCI+LV-EGFP组与bCCI组相比各指标无明显差异（P>0.05）；bCCI+LV-Nanog-EGFP组与bCCI组相比各指标有显著性差异（P<0.05）。体视学影像分析系统计数显示突触和神经元数量的比例bCCI组、bCCI+生理盐水组、bCCI+LV-EGFP组较假手术组显著增加（P<0.01），bCCI+生理盐水组、bCCI+LV-EGFP组与bCCI组相比无明显差异（P>0.05）；bCCI+LV-Nanog-EGFP组与bCCI组相比有显著性差异（P<0.05）。结论：慢病毒介导的Nanog基因脊髓背角直接注射可以减少bCCI后脊髓背角Syn、P65的表达，增加MOR、CCK-8的表达，降低突触和神经元数量的比例，提高疼痛阈值水平，具有治疗神经病理性疼痛的作用，是一个有效的基因治疗策略。