论文部分内容阅读
第一部分UBE2C在子宫内膜癌中的表达及其临床意义
目的：研究UBE2C在子宫内膜癌组织中的表达，探讨UBE2C与子宫内膜癌临床病理特征和预后的关系。
方法：运用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blot)分析正常子宫内膜及子宫内膜癌组织中UBE2C的表达水平；运用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中543例子宫内膜癌样本和23例正常样本数据验证UBE2C的表达差异，探讨UBE2C与肿瘤复发、病理分级、病理分型、FIGO分期以及总体生存率的关系。
结果：1、子宫内膜癌组织中UBE2C的mRNA和蛋白水平均明显高于正常子宫内膜组织。2、TCGA数据验证UBE2C在子宫内膜癌组织中显著上调，UBE2C高表达更常见于肿瘤复发、更高的病理分级、更高的FIGO分期、恶性程度更高的病理分型的患者中，并且高表达UBE2C的患者总体生存率低于UBE2C低表达的患者。
结论：UBE2C在子宫内膜癌中呈高表达状态，并且与患者的不良预后相关，提示UBE2C可能在子宫内膜癌的发生发展中发挥着重要的作用。
第二部分UBE2C促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移以及侵袭
目的：探究UBE2C对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响。
方法：运用westernblot分析四种子宫内膜癌细胞系(Ishikawa，RL95-2，HEC-1B， KLE)中UBE2C的表达水平；构建靶向UBE2C的短发卡RNA(shUBE2C)和过表达质粒，分别转染Ishikawa和KLE细胞，qRT-PCR和westernblot检测转染后UBE2C以及EMT相关标志物的表达变化；CCK8实验检测细胞的增殖能力；Transwell小室检测细胞迁移侵袭的能力。
结果：1、UBE2C在Ishikawa和RL95-2细胞中的表达较高，在KLE和HEC-1B细胞中的表达较低。2、沉默UBE2C后Ishikawa细胞的增殖、迁移及侵袭能力减弱，EMT上皮标志E-cadherin的表达升高，间质标志物Vimentin的表达降低；相反，过表达UBE2C后KLE细胞的增殖、迁移及侵袭能力增强，E-cadherin的表达下降，Vimentin的表达升高。
结论：UBE2C可促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT。
第三部分UBE2C通过p53调控子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭
目的：探讨UBE2C通过调控p53的表达对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭及EMT的影响以及UBE2C对p53的调控机制。
方法：运用qRT-PCR和westernblot检测沉默和过表达UBE2C后Ishikawa和KLE细胞内UBE2C、p53的表达变化；使用放线菌酮(CHX)或者蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，westernblot检测p53的表达变化；免疫共沉淀技术检测沉默以及过表达UBE2C后p53泛素化水平的变化；Transwell实验和westernblot检测沉默、过表达UBE2C以及回补p53表达后细胞迁移侵袭能力和E-cadherin、Vimentin表达的变化。
结果：1、沉默UBE2C后，Ishikawa细胞内p53的蛋白水平升高，过表达UBE2C后KLE细胞内p53的蛋白表达降低，然而沉默或者过表达UBE2C后p53的mRNA水平无明显变化。2、沉默UBE2C后p53的泛素化水平降低，蛋白稳定性增加；过表达UBE2C后p53的泛素化水平升高，蛋白稳定性降低，并且此过程可被MG132逆转。3、沉默UBE2C后子宫内膜癌细胞的迁移侵袭能力减弱，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调，同时沉默p53后细胞的迁移侵袭能力恢复，E-cadherin表达下调，Vimentin表达上调；过表达UBE2C后细胞的迁移侵袭能力增强，E-cadherin表达下调，Vimentin表达上调，同时过表达p53后细胞的迁移侵袭能力下降，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调。结论：UBE2C可能通过增强p53的泛素化，促进其蛋白酶体途径的降解，从而降低p53的蛋白水平，调控子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭及EMT。
第四部分子宫内膜癌中雌激素与UBE2C的调控关系及其机制研究
目的：探讨雌激素与UBE2C之间的调控关系以及雌激素对UBE2C的调控机制。方法：运用westernblot和免疫组化分析四种子宫内膜癌细胞系以及10例子宫内膜癌标本中UBE2C及ERα的表达水平；采用不同浓度雌激素处理Ishikawa、RL95-2和HEC-1B细胞，westernblot及qRT-PCR检测UBE2C的表达变化；采用westernblot检测雌激素和雌激素受体抑制剂ICI182780处理后细胞内UBE2C的表达变化；荧光素酶报告分析雌激素对UBE2C启动子的激活作用；Transwell和westernblot实验检测沉默UBE2C对雌激素诱导的子宫内膜癌细胞迁移侵袭、p53及EMT指标变化的影响；选5周龄的雌性裸鼠皮下种植Ishikawa细胞，给予每周一次皮下注射雌激素，24天后处死，取下瘤体，称重，免疫组化分析瘤体组织E-cadherin和Vimentin的表达情况。
结果：1、在子宫内膜癌细胞系(相关系数r=-0.9609，P=0.0391)以及组织标本(相关系数r=-0.6640，P=0.0363)中，UBE2C与ERα的表达呈正相关。2、雌激素处理ERα阳性的Ishikawa和RL95-2细胞后，UBE2C的表达升高，并且ICI182780可以阻断雌激素上调UBE2C的作用。3、雌激素处理ERα阴性的HEC-1B细胞后，UBE2C的表达无明显变化，过表达ESR1后再用雌激素处理，UBE2C的表达显著升高。4、JASPAR数据库预测UBE2C启动子区可能存在ESR1结合位点(位于转录起始点上游-620bp--601bp)，荧光素酶报告显示雌激素通过此位点增强UBE2C的转录活性。5、雌激素可促进子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭，并且下调E-cadherin和p53的蛋白表达，上调Vimentin的蛋白表达，而沉默UBE2C后，雌激素的这些效应被逆转。6、与control组相比，雌激素处理后，瘤体重量增加，E-cadherin表达降低，Vimentin表达增高，而shUBE2C组瘤体重量下降，E-cadherin表达增高，Vimentin表达降低；相对于雌激素处理组，雌激素+shUBE2C组瘤体重量下降，E-cadherin表达增高，Vimentin表达降低。
结论：ERα和UBE2C在子宫内膜癌组织和细胞系中的表达呈正相关，雌激素可通过ERα结合UBE2C的启动子区域转录激活UBE2C的表达。沉默UBE2C可在体内外降低雌激素促子宫内膜癌细胞迁移、侵袭以及EMT的能力。
目的：研究UBE2C在子宫内膜癌组织中的表达，探讨UBE2C与子宫内膜癌临床病理特征和预后的关系。
方法：运用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(western blot)分析正常子宫内膜及子宫内膜癌组织中UBE2C的表达水平；运用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中543例子宫内膜癌样本和23例正常样本数据验证UBE2C的表达差异，探讨UBE2C与肿瘤复发、病理分级、病理分型、FIGO分期以及总体生存率的关系。
结果：1、子宫内膜癌组织中UBE2C的mRNA和蛋白水平均明显高于正常子宫内膜组织。2、TCGA数据验证UBE2C在子宫内膜癌组织中显著上调，UBE2C高表达更常见于肿瘤复发、更高的病理分级、更高的FIGO分期、恶性程度更高的病理分型的患者中，并且高表达UBE2C的患者总体生存率低于UBE2C低表达的患者。
结论：UBE2C在子宫内膜癌中呈高表达状态，并且与患者的不良预后相关，提示UBE2C可能在子宫内膜癌的发生发展中发挥着重要的作用。
第二部分UBE2C促进子宫内膜癌细胞增殖、迁移以及侵袭
目的：探究UBE2C对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响。
方法：运用westernblot分析四种子宫内膜癌细胞系(Ishikawa，RL95-2，HEC-1B， KLE)中UBE2C的表达水平；构建靶向UBE2C的短发卡RNA(shUBE2C)和过表达质粒，分别转染Ishikawa和KLE细胞，qRT-PCR和westernblot检测转染后UBE2C以及EMT相关标志物的表达变化；CCK8实验检测细胞的增殖能力；Transwell小室检测细胞迁移侵袭的能力。
结果：1、UBE2C在Ishikawa和RL95-2细胞中的表达较高，在KLE和HEC-1B细胞中的表达较低。2、沉默UBE2C后Ishikawa细胞的增殖、迁移及侵袭能力减弱，EMT上皮标志E-cadherin的表达升高，间质标志物Vimentin的表达降低；相反，过表达UBE2C后KLE细胞的增殖、迁移及侵袭能力增强，E-cadherin的表达下降，Vimentin的表达升高。
结论：UBE2C可促进子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT。
第三部分UBE2C通过p53调控子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭
目的：探讨UBE2C通过调控p53的表达对子宫内膜癌细胞迁移、侵袭及EMT的影响以及UBE2C对p53的调控机制。
方法：运用qRT-PCR和westernblot检测沉默和过表达UBE2C后Ishikawa和KLE细胞内UBE2C、p53的表达变化；使用放线菌酮(CHX)或者蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，westernblot检测p53的表达变化；免疫共沉淀技术检测沉默以及过表达UBE2C后p53泛素化水平的变化；Transwell实验和westernblot检测沉默、过表达UBE2C以及回补p53表达后细胞迁移侵袭能力和E-cadherin、Vimentin表达的变化。
结果：1、沉默UBE2C后，Ishikawa细胞内p53的蛋白水平升高，过表达UBE2C后KLE细胞内p53的蛋白表达降低，然而沉默或者过表达UBE2C后p53的mRNA水平无明显变化。2、沉默UBE2C后p53的泛素化水平降低，蛋白稳定性增加；过表达UBE2C后p53的泛素化水平升高，蛋白稳定性降低，并且此过程可被MG132逆转。3、沉默UBE2C后子宫内膜癌细胞的迁移侵袭能力减弱，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调，同时沉默p53后细胞的迁移侵袭能力恢复，E-cadherin表达下调，Vimentin表达上调；过表达UBE2C后细胞的迁移侵袭能力增强，E-cadherin表达下调，Vimentin表达上调，同时过表达p53后细胞的迁移侵袭能力下降，E-cadherin表达上调，Vimentin表达下调。结论：UBE2C可能通过增强p53的泛素化，促进其蛋白酶体途径的降解，从而降低p53的蛋白水平，调控子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭及EMT。
第四部分子宫内膜癌中雌激素与UBE2C的调控关系及其机制研究
目的：探讨雌激素与UBE2C之间的调控关系以及雌激素对UBE2C的调控机制。方法：运用westernblot和免疫组化分析四种子宫内膜癌细胞系以及10例子宫内膜癌标本中UBE2C及ERα的表达水平；采用不同浓度雌激素处理Ishikawa、RL95-2和HEC-1B细胞，westernblot及qRT-PCR检测UBE2C的表达变化；采用westernblot检测雌激素和雌激素受体抑制剂ICI182780处理后细胞内UBE2C的表达变化；荧光素酶报告分析雌激素对UBE2C启动子的激活作用；Transwell和westernblot实验检测沉默UBE2C对雌激素诱导的子宫内膜癌细胞迁移侵袭、p53及EMT指标变化的影响；选5周龄的雌性裸鼠皮下种植Ishikawa细胞，给予每周一次皮下注射雌激素，24天后处死，取下瘤体，称重，免疫组化分析瘤体组织E-cadherin和Vimentin的表达情况。
结果：1、在子宫内膜癌细胞系(相关系数r=-0.9609，P=0.0391)以及组织标本(相关系数r=-0.6640，P=0.0363)中，UBE2C与ERα的表达呈正相关。2、雌激素处理ERα阳性的Ishikawa和RL95-2细胞后，UBE2C的表达升高，并且ICI182780可以阻断雌激素上调UBE2C的作用。3、雌激素处理ERα阴性的HEC-1B细胞后，UBE2C的表达无明显变化，过表达ESR1后再用雌激素处理，UBE2C的表达显著升高。4、JASPAR数据库预测UBE2C启动子区可能存在ESR1结合位点(位于转录起始点上游-620bp--601bp)，荧光素酶报告显示雌激素通过此位点增强UBE2C的转录活性。5、雌激素可促进子宫内膜癌细胞的迁移、侵袭，并且下调E-cadherin和p53的蛋白表达，上调Vimentin的蛋白表达，而沉默UBE2C后，雌激素的这些效应被逆转。6、与control组相比，雌激素处理后，瘤体重量增加，E-cadherin表达降低，Vimentin表达增高，而shUBE2C组瘤体重量下降，E-cadherin表达增高，Vimentin表达降低；相对于雌激素处理组，雌激素+shUBE2C组瘤体重量下降，E-cadherin表达增高，Vimentin表达降低。
结论：ERα和UBE2C在子宫内膜癌组织和细胞系中的表达呈正相关，雌激素可通过ERα结合UBE2C的启动子区域转录激活UBE2C的表达。沉默UBE2C可在体内外降低雌激素促子宫内膜癌细胞迁移、侵袭以及EMT的能力。