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白血病或肿瘤的发病过程通常伴随着融合基因的产生,融合基因可促进肿瘤的产生和发展,并可作为肿瘤的分子诊断和治疗靶标。MLL-AF9基因融合在急性髓系白血病(AML)病人中较为常见,构建MLL-AF9的细胞模型对研究AML的发病机理与药物发现有很重要的意义。CRISPR-Cas9是近年来发展起来的一种新型基因编辑技术,其构建和使用非常方便并且成本较低,可同时对多个基因进行编辑,已用于构建多种基因融合模型,但是打靶效率较低,小于10%,亟需提高其打靶效率。本文提出了一种利用CRISPR-Cas9技术在体外高效构建MLL-AF9融合基因的新策略。(1)在MLL基因的第10个内含子与AF9基因的第5个内含子中设计并筛选出高效作用的sgRNA。(2)设计一种全新的打靶载体p EASY-Blunt-MLL-GFP-AF9(2Loxp),以p EASY-Blunt作为载体,分别插入MLL和AF9基因的同源臂序列来介导同源重组,并且该载体中含有可敲除的GFP筛选基因。(3)将高效的MLL sgRNA,AF9 sgRNA和打靶载体同时转染人HEK293T细胞,两条sgRNA分别在MLL和AF9基因的相应位点造成切口,在打靶载体的作用下,通过同源重组使MLL基因前10个外显子和AF9基因的第6-7个外显子融合在一起形成新的融合基因,最后通过Cre-Loxp系统将GFP基因敲除。(4)通过293T细胞基因组DNA的PCR及测序来鉴定发生MLL-AF9重组的293T细胞,从目前结果来看重组效率可高达30%,比以前的方法有极大的提高。(5)通过荧光原位杂交技术观察在293T细胞中MLL和AF9基因的状态,但是并没有检测到融合基因的存在,可是由于293T细胞为多倍体,无法准确的检测到所有的染色体,可通过换一个两倍体的细胞系来进一步观察。本文创立了一种利用CRISPR-Cas9技术高效构建基因融合的方法。从PCR实验结果来看,设计的新的打靶载体可通过介导同源重组来有效地提高融合效率,我们后续会通过更换其他细胞系来进一步优化实验条件体系。该策略的成功建立,将显著提高融合基因的打靶效率,为构建染色体基因融合细胞模型提供新的技术手段,并为研究肿瘤等相关疾病的作用机制奠定基础。