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目的:利用靶向AAVS1的端粒酶基因及Crispr/Cas9技术构建永生化的脐带间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）系,通过流式细胞分选仪从中分选出高表达BDNF的细胞亚群,为缺血性脑损伤的基础与临床研究提供BDNF高表达单克隆细胞亚群。方法:1.构建靶向AAVS1的hTERT/GFP质粒及Crispr/Cas9质粒:通过酶切从自供血液提取的人类DNA序列中获得HAL及HAR基因序列,从PLK0.1质粒中获得hPGK基因序列,从PX458质粒中获得FlagX3、T2A-bGH、GFP基因序列,从购买的pBABE-neo-hTERT质粒中获得hTERT基因序列,并通过PCR桥接、载体连接、质粒转化等方式将上述基因序列通过特定的顺序连接获得hTERT/GFP质粒。2.筛选传代的BDNF高表达的MSC细胞:收集第1-9代MSC细胞上清液,进行BDNF ELISA检测,选择BDNF高表达的一代细胞进行后续实验。3.质粒共转染:将hTERT/GFP质粒重组整合入Crispr/Cas9靶向AAVS1位点共转染进入MSC细胞;经GFP荧光挑选hTERT/GFP基因阳性表达的MSC细胞;并使用rt-PCR法检测hTERT在MCS细胞转染前后的表达。4.筛选永生化高表达BDNF的MSC细胞亚群:使用流式细胞仪将hTERT/GFP阳性的MSC细胞及未转染的MSC细胞分别分选到两个96孔板中,每孔1个细胞,放置37℃,5%CO2培养箱中培养,观察细胞增殖,并扩大培养。使用ELISA法分别检测上述细胞上清液中BDNF的表达。结果:1.通过酶切、连接、重组、转化等方式,成功构建hTERT/GFP质粒,并成功测序。2.通过ELISA法检测出第七代细胞为BDNF表达最高的一代（P<0.001）。使用转染技术将hTERT/GFP、Crispr/Cas9质粒转染进入第七代MSC细胞中,形成永生化MSC细胞系并通过rt-PCR定量分析,提示转染成功并稳定表达。3.分选型流式细胞仪筛选为单细胞,扩大培养,使用ELISA法得到转染质粒组（MSC-GFP组）浓度为941.51+201.90pg/ml,BDNF浓度最高亚群为1311.29pg/ml,MSC组浓度为959.23+205.75 pg/ml,两组间统计无差异（P>0.05）。提示MSC细胞永生化后并未改变细胞分泌BDNF蛋白的水平。结论:利用Crispr/Cas9技术及靶向AAVS1的端粒酶基因能够成功构建永生化MSC细胞并能分泌与稳定表达BDNF。