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目的: 近年来，通过生物信息学预测，结合分子生物学技术，大量小非编码RNA(smallnon coding RNA，sRNA)在各类细菌中被发现，相关研究已成为热点。T64为本实验室在伤寒沙门菌野生株Salmonella enterica serovar Typhi(S.Typhi)中新发现的一个疑似sRNA，其基因位于yegD基因和一个假定蛋白基因的间区。本论文拟对该sRNA T64的分子表达特性及在伤寒沙门菌中的相关功能进行初步研究。 方法: 1.S.Typhi sRNA T64分子鉴定及表达特性分析:设计sRNA T64特异性杂交探针，用同位素P32标记探针，利用Northern Blot技术鉴定T64在野生株中的表达。采用cDNA末端快速扩增法(5-/3-RACE)，确定T64分子的全长序列信息。 2.S.Typhi sRNA T64表达特性分析:用Northern Blot和反转录荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析S.Typhi野生株在普通生长条件各个时相的sRNA T64的表达情况。将对数生长期(OD6000.4)野生株进行酸、高渗和氧应激，模拟体内感染环境，用同样的方法分析T64在STyph各种应激条件下的表达特性。 3.sRNA T64缺陷变异株的构建:利用λ-red重组系统构建sRNA T64的基因缺陷变异株。首先在sRNA T64基因上下游设计一对含有同源臂和Kanar基因特异性引物，并以质粒pET28a(Kanar)为模板进行PCR扩增，将产物片段电转入S.Typhi-pKD46感受态细胞中，并在含卡那霉素LB平板中培养，筛选出发生重组的变异株。 4.sRNA T64高表达菌株的构建:在sRNA T64基因转录起始和终止位区域处设计一对带有NocⅠ和HindⅢ限制性酶切位点的引物。用PCR扩增出带双酶切位点的sRNA T64基因特异性片段，通过酶切和连接，将其插入pBAD/Myc-HisA载体，经过酶切、PCR和测序验证后，电转入S.Typhi中以构建T64高表达菌株。 5.sRNA T64基因回补株的构建:构建含有sRNA T64基因的重组质粒，并电转入伤寒沙门菌T64缺陷株，以构建sRNA T64基因回补株。 6.S.Typhi基因表达谱分析:当S.Typhi sRNA T64高表达株和空载体对照株在LB培养液中生长到OD6000.4时，加入L-阿拉伯糖诱导高表达T64(30min)后提取总细菌RNA，反转录并用Cy3-、Cy5-配对互标cDNA后，与S.Typhi基因组芯片进行杂交，用双通道扫描分析系统基因表达。 7.qRT-PCR分析S.Typhi的基因表达差异:将空载体对照株和T64高表达株在普通LB中培养到对数期，加入L-阿拉伯糖诱导T64表达，提取两株菌的总RNA，用特异性引物反转成cDNA后，再进行qRT-PCR，分析两菌株中各基因表达水平差异。 8.各模型菌株生长曲线测定:将sRNA T64缺陷株、野生株、sRNA T64高表达株和空载体对照株分别在普通LB中振荡培养，测量每小时菌液的OD600值，连续测量12小时并绘制生长曲线。当各菌株长到对数生长期(OD6000.4)时，分别加一定量的HCL、NaCl和H2O2，模拟细菌各种应激条件，继续培养并测OD600值绘制生长曲线。 结果: 1.Northern Blot和RT-PCR的结果显示，在S.Typhi中sRNA T64确实存在表达，且其在细菌生长稳态期和酸应激情况下表达量上升，氧应激下表达量明显下降。 2.RACE结果提示，T64的全长为138bp，其基因的编码区位于yegD基因和一个假定蛋白基因的间区。 3.通过λ-red重组系统成功制备sRNA T64缺陷株(ΔT64);成功构建了T64高表达株(pBAD-T64)，T64缺陷回补株（ΔT64+ pBAD-T64）和空载体回补对照株(ΔT64+pBAD)。 4.基因芯片分析结果提示，在T64基因高表达后有52个基因表达上调，28个表达下调。其中4个基因经实时荧光定量PCR分析，结果与芯片分析一致。表达差异基因与细菌的侵袭、毒力、胞内生存、生长复制、代谢和生物膜形成等相关。 5.生长曲线结果提示，ΔT64在氧应激下生长受到抑制，高表达sRNA T64后，细菌在普通条件下生长速度受到抑制。 结论: 在S.Typhi中鉴定出一个新的sRNA T64，长度为138bp，其在细菌生长稳态期和酸应激下的表达增多，在氧应激下表达降低;高表达T64可能影响S.Typhi代谢，毒力和生物膜形成相关的基因表达。生长曲线揭示，高表达T64能使抑制细菌生长速度。