根癌农杆菌介导的ACS反义基因和PEAS基因转化香蕉研究

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 28次 | 上传用户:tangroo
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本研究以香蕉(Musa spp.)品种“天宝蕉”(Musa spp.,AAA类群)为试验材料,采用根癌农杆菌介导法对香蕉遗传转化体系进行了较为全面的研究。优化了香蕉横切薄片转化系统:并以该系统进行了ACS反义基因转化香蕉的研究,筛选抗性香蕉芽并再生植株:对转ACS反义基因的薄片进行GUS瞬时表达检测、再生植株叶片的GUS稳定表达检测及gus基因的PCR检测;并在实验室原有基础上进行PEAS基因转化体系的优化、再生植株叶片hpt基因的PCR检测、移栽等工作。主要研究结果如下: 1 优化香蕉横切薄片培养系统。通过调整香蕉横切薄片直接出芽过程中外植体来源、激素种类及浓度、AgNO3等影响因素,优化香蕉转基因受体系统。选取香蕉低代试管苗的球茎顶端分生组织直接接于不附加其他生长调节剂的MS基本培养基上,可获得较高的出芽率:附加2 mg·L-1AgNO3的芽诱导培养基可促进香蕉芽的分化:于MS+1.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-1NAA+80 mg·L-1Ad培养基继代20 d的香蕉低代试管苗的球茎顶端分生组织的横切薄片适宜作为香蕉遗传转化的直接受体;香蕉薄片对卡那霉素较为敏感,确定100 mg·L-1为筛选工作浓度。 2 以根癌农杆菌介导将ACS反义基因导入香蕉,并对转化条件进行了优化研究。优化后的条件为:不经预培养的香蕉茎尖横切薄片,侵染前用附加0.1 mg·L-1甘露醇的高渗固体培养基前处理4 h,农杆菌重悬液浓度为OD6001.0左右,重悬液中含100 g·L-1的蔗糖,接菌时间为10~15 min,于26℃黑暗条件下共培养4 d,共培养培养基pH值为5.8。以此条件进行了稳定转化试验。 3 建立香蕉抗性芽筛选、再生植株与转基因检测的技术体系,对转化ACS反义基因薄片进行抗性芽筛选及转基因植株再生研究,对薄片进行GUS瞬时表达检测、再生植株叶片的GUS稳定表达检测和gus基因的PCR检测。采用附加100 mg·L-1卡那霉索、2 mg·L-1 AgNO3的筛选培养基对共培养后的香蕉横切薄片进行筛选,共获得5个转ACS反义基因的抗性芽系,其中AgNO3可以抑制残留农杆菌的生长、促进抗性芽的分化。并以这些抗性芽为试验材料进行再生植株的研究,共获得了再生植株30株。经PCR检测,gus基因已整合进香蕉基因组,其中来自稳定表达GUS的抗性芽,经GUS组织化学检测为转基因植株,其余来自不表达GUS的抗性芽,经检测为不表达GUS的植株。 4 PEAS基因导入香蕉研究的后续工作。在实验室原有的PEAS基因转化香蕉初步研究的基础上进行优化,并对转基因再生植株进行分子检测、移栽及其生长情况的观察。结果表明,通过活化农杆菌、在抗性筛选培养基上添加3 mg·L-1AgNO3抑制残留的农杆菌生长,提高转化效率:经PCR检测,hpt基因已整合进香蕉基因组中;移栽的50株转基因植株中发现了1株嵌合体植株。 本研究对转基因技术在香蕉品种改良上有重要意义,并为香蕉转基因的研究提供了技术基础。
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