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背景:结核病(Tuberculosis,TB)是长期危害人类健康的严重疾病之一。近年来,由于HIV和结核分枝杆菌双重感染,以及耐药型结核分枝杆菌的流行,导致结核病的发病率和死亡率大幅度上升。全球大约已有三分之一人口感染了结核分枝杆菌,但仅有十分之一的感染者会进一步发展为临床结核病,这提示宿主的遗传因素与结核病易感性有关。潜伏结核病与活动性结核病是感染结核后分别处于不发病状态和发病状态的两大人群,以此为对象研究两组人群之间的遗传差异具有一定价值。甘露糖结合凝集素(mannose-bindinglectin,MBL),是一种钙离子依赖的(C型)血清凝集素,在防御抵抗多种病原微生物的天然免疫中起着重要的作用。在结核感染后不同疾病状况的人群中研究MBL的基因遗传差异、外周表达差异以及发生机制对于揭开结核病发病机制中的遗传因素具有一定意义。
目的:利用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)技术筛选结核潜伏感染人群,将其与活动性结核病患者作为结核遗传易感性的研究对象,研究中国汉族人群甘露糖结合凝集素(Mannose-bindinglectin,MBL)基因多态性的差异及其与结核发病的相关分析和潜在机制。
方法:(1)采用T-SPOTTB试剂盒对287例结核患者的长期密切接触者进行结核潜伏感染人群的筛选。(2)采用多元连接酶检测反应等位基因精确分型法(AMLR)对MBL基因的6个SNP位点(L/H位点、Y/X位点、P/Q位点、A/D位点、A/B位点、A/C位点)进行基因分型,其中活动性结核人群(TB组,n=449例)、结核潜伏感染人群(LTB组,n=125例)、健康人群(HC组,n=249例)。(3)采用ELISA方法检测血浆中MBL蛋白表达水平(TB组,n=139例;LTB组,n=124例;HC组,n=155例)。(4)采用统计学方法分析TB组、LTB组、HC组三组人群中MBL基因多态性与结核病发病的相关性。(5)采用双荧光素酶报告基因方法,在NIH3T3细胞中,检测MBL基因不同单倍型的启动活性。
结果:(1)ELISPOT技术从287例结核患者的长期密切接触者中筛选到结核潜伏感染者125例,检测阳性率为43.6％(125/287);
(2)携带-550GG基因型的HC组与TB组比较,OR=0.70,95％CI=0.47-1.04,P值为0.075,提示基因型GG对结核的发生有保护作用的趋势;
(3)按性别分层,在-550位,GG基因型在TB组和HC组之间的男性中有显著性差异,OR=0.42,95％CI=0.20-0.86,P值为0.019,提示在男性中GG基因型对结核的发生有明显的保护作用。在女性中,外显子1区的54(B)位点基因型在三组不同人群中显示有显著性差异,P=0.039;
(4)启动子区-550位C/G(L/H)和外显子1区的54(B)G/A(A/B)两个位点都与MBL水平有相关性,P值＜0.001;
(5)15种不同单倍型组合的MBL蛋白水平具有显著性差异,P值＜0.001;
(6)ELISA方法检测血浆MBL蛋白水平发现,活动性结核组MBL水平最高,健康人群MBL水平次之,而结核潜伏人群最低,三组人群之间MBL蛋白水平具有显著性差异(P值＜0.001),说明低水平的MBL与机体抵抗结核病相关;
(7)双荧光素酶报告基因分析显示,MBL基因不同单倍型的启动活性大小依次为:pGL3-basic-HYP＞pGL3-basic-LYP＞pGL3-basic-LYQ＞pGL3-basie-LXP;这正印证了ELISA的结果:HYPA/HYPA对应的MBL水平最高,LXPA/LXPA对应的MBL水平最低,也就是说,在MBL结构基因的54位SNP位点基因型为野生纯合子AA时,体现出启动子区不同的单倍型对基因表达产物的调控作用强弱也不同。
(8)在健康对照人群和结核潜伏感染人群之间未发现MBL基因多态性分布的差异。
结论:中国汉族人群MBL基因多态性及血浆MBL水平高低与肺结核发病的易感性相关。男性中MBL基因-550位点基因型GG对结核的发生有明显的保护作用。同时,我们的研究结果支持维持低水平的MBL与机体抵抗结核病相关的结论。MBL基因多态性可能通过影响启动子活性和外显子区的功能来影响MBL的水平表达,进而影响到对结核病的易感性。