背景与目的地中海贫血（简称：地贫），是一种由于珠蛋白合成比例失衡所导致的严重的致死性血红蛋白病，也是世界上最常见的人类单基因遗传病之一。最新的数据表明，该类疾病的基因携带者占全球人口总数的4.83％，我国的高发区主要分布于长江以南各省区，其中广西、广东和海南三省（区）为我国发生率最高的地区。其中广东省人群中α和β地贫总的基因携带率为11％。从1949年Pauling发现HbS并提出“分子病”的概念至今，在过去的50余年间，围绕血红蛋白病的分子病理学研究为我们认识人类基因和真核基因的表达调控提供了许多经典的知识。近年来，随着人类基因组计划的完成，在基因组学研究理论的指导下，许多关于地贫基因新的变异研究结果为我们对导致地贫的发病机制有了一些新的认识，同时也大大的丰富了人类珠蛋白基因突变谱。许多的突变，特别是一些位于珠蛋白基因启动子区以及5’UTR，3’UTR等保守功能区域的新突变的鉴定，以及通过此类自然突变所延伸的针对珠蛋白（尤其是β-珠蛋白）的转录水平，翻译水平的相关研究，这些研究不仅揭示并充实了人类对于β-珠蛋白基因表达调控具体理论机制的认识，同时也丰富了血红蛋白病的病因学，也为我们深入系统地认识人类遗传病的各种可能的发病机制开启了新的思路。中间型β地贫（thalassemia intermedia）是临床表现介于重型β地贫（thalassemia major）和轻型β地贫（thalassemia trait）之间的一类地贫，其临床表现和遗传缺陷背景有很大的遗传异质性，目前国际上公认的对中间型β地贫患儿的主要诊断标准为：（1）Hb含量6-10g／L；（2）红细胞参数和血红蛋白（Hb）电泳符合地贫的特征；（3）患儿不依赖输血可以维持生活；（4）临床表现有较明显地贫的症状和体征。基于经典遗传学概念的欧洲地贫高发区人群中该类地贫可能的遗传缺陷背景已基本阐明，但仍有许多不明原因的基因缺陷有待鉴定。我国人群中这类中间型地贫的研究仅有少数个案报道，尚未有系统的针对这类特殊地贫的基因突变谱及其变化规律的研究结果，这一状态严重妨碍了我国南方这一重要遗传病临床诊治、产前诊断和遗传咨询工作的深入开展。β-珠蛋白基因转录起始位点上游启动子区的顺式作用元件包含有4个保守序列，如保守序列-30—-26的TATA盒，-76—-72位的CCAAT盒，-90—-80位的近端CACCC盒以及位于-105—-101的远端CACCC盒，一直以来，这四个保守序列及其与相应的反式作用因子的结合关系，是人们对β-珠蛋白基因表达研究的热点问题。在以往的许多研究中，通过对相关类型珠蛋白基因—α-珠蛋白基因、γ-珠蛋白基因、δ-珠蛋白基因等珠蛋白的启动子区的凝胶阻滞、甲基化干扰以及饱和诱变实验，发现大多数突变使相应转录因子与此保守序列的亲合力下降，从而导致基因的转录效率降低，mRNA生成量减少而产生β⁺或β⁺⁺地贫表型。近30年来，随着人们对地贫分子机理的认识程度的加深及临床基因诊断技术的进步，同时在许多地贫高发区的大人群地贫筛查得到了有效的施行，越来越多的相关地贫突变类型得到了阐述。在这些已经得到证实的新突变类型中，截至目前为止，属于β-地贫突变的有37种之多（包括有导致转录降低、转录后修饰（即RNA加工）错误和翻译错误等三大突变类型），其中位于β-珠蛋白转录起始区上游启动子区保守序列突变主要是一些导致转录降低的突变种类（通常是一些相关保守区位点的碱基置换），包括我们的研究工作中所发现的新突变，位于β-珠蛋白转录起始区上游启动子区的新突变数量已达21种。在我们的研究工作中，获得了一个典型的中间型β地贫家系，通过对家系相关成员的基因型分析，我们在位于β-珠蛋白基因启动子保守序列-76—-72的CCAAT盒中发现一个新的突变位点—-73 A＞T突变，这是世界上首次在β-珠蛋白CCAAT盒内发现的新突变类型。材料与方法先证者为一个8岁男孩，4岁时于医院诊断发现有贫血症状，轻微脾肿大，轻度面容改变，临床诊断为中间型β-地中海贫血，来我室诊断前尚未进行过输血治疗。双亲祖籍均为广东，先证者的父亲红细胞呈典型小细胞低色素性改变，即MCV和MCH均降低，分别是62.8fL和19.3pg，并且HBA₂为5.3％，明显升高，临床诊断为轻型β地贫（β地贫基因携带者）。先证者的母亲和两个舅舅为静止型β-地贫表型——MCV，MCH处于临界值或正常（分别是79.8fL／28.4pg，89.1fL／28.0pg，90.0fL／28.1pg）。三人的HBA₂水平分别为3.84％，3.95％，3.76％，略有升高。通过对先证者和其家庭成员的24种中国人群常见β-珠蛋白基因突变分析，仅发现一种常见突变—CDs41-42（-TCTT），为先证者和其父亲所携带，而未检测到先证者另一条染色体（源自其母亲）的突变基因。为了有效评估新突变导致β-珠蛋白表达水平相对正常人的降低情况，我们设计了实时荧光定量RT-PCR实验对先证者的母亲及两个舅舅3名新突变携带者的β-珠蛋白基因进行了相对定量实验。此外，我们还选择了β-珠蛋白基因簇上7个经典的限制性酶切位点，采用基于PCR的限制性片断长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）单倍型结合家系连锁分析的方法，阐明了先证者两条β-地贫（β^T）染色体所对应的RFLP单倍型。为了将此新突变所对应的基因型与最新的地贫突变检测技术相结合，我们设计并优化了涵盖突变区域的PCR扩增引物，并运用变性高效液相色谱（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）对突变携带者进行了相应的基因分型。结果与讨论通过PCR扩增先证者及其家系成员β-珠蛋白基因全长片断，并对PCR产物直接进行DNA序列分析，我们发现，在先证者另一条染色体的β-珠蛋白基因启动子区（-73位置）存在一个A＞T的单碱基置换，DNA反向测序，及在先证者母亲与其两个舅舅的β-珠蛋白基因的相应区域的局部测序证实了此位点的突变。经文献检索和查询珠蛋白基因服务网站（http://globin.cse.psu.edu/）内的“人类血红蛋白变异和地贫突变的在线数据库”证实此突变是世界上未曾报道的β地贫新突变类型。简言之，先证者为一个β地贫双重突变杂合子，2条染色体上β-珠蛋白基因的缺陷分别是：CDs41-42（-TCTT）缺失突变，遗传自其父亲；-73 A＞T碱基置换突变，源自其母亲，可见，该家系地贫基因的遗传方式属典型的常染色体隐性遗传。由于关于β-珠蛋白基因保守区域-76—-72的CCAAT盒中的天然突变的发现在国内外尚属首次，我们根据以往文献报道的关于β-珠蛋白基因启动子区其他保守序列，诸如位于nt-105—-101和nt-90—-86的CACCC盒，以及位于nt-30—-26的CATAAA盒（又名TATA盒），的研究数据，加之一些人为诱变导致γ-珠蛋白基因相应区域变异的基因表达数据以及我们研究中所获得的家系的表型数据对新突变所导致的β-珠蛋白表达水平降低程度应该列为β⁺或者β⁺⁺类型。通过我们后续的基于双标准曲线的两步法实时荧光定量RT-PCR研究证实了该新突变所导致的β珠蛋白mRNA相对正常人群的降低水平为19.35％，其对应的地贫表型应为β⁺⁺。通过基于RFLP结合家系分析的方法，我们得出“+----+-”与-73突变连锁，“+----++”与CD41／42（-TCTT）突变连锁。通过对新突变区域的半变性DHPLC分析，我们得到了与-73 A＞T突变相关的特异洗脱峰型，此分型结果可用于随后的对-73 A＞T突变携带者的基因诊断。-73 A＞T突变属世界上首次在β-珠蛋白基因启动子CCAAT盒所发现的突变，它丰富了我国南方人群中间型地贫的基因突变谱，为理解中间型地贫的遗传异质性和人类遗传病的病因学提供新的遗传学知识，同时为详细探讨β-珠蛋白基因表达调控机制提供了天然突变模型。