当归是我们祖国传统中药,已有上千年的使用历史。中医里的当归是我国甘肃岷县道地药材伞形科多年生草本植物当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)的根茎干燥而成,常用于补血活血和调经止痛。当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide)分离自当归根饮片,具有显著的药理活性,是当归中的发挥药理功效的主要成分之一。现代医学研究表明当归多糖具有抗氧化、免疫调节、抗贫血、抗炎、调节糖脂代谢紊乱等药理作用。本课题旨在明确当归多糖对代谢综合征相关疾病,即2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)和酒精性脂肪肝(AFLD)的治疗作用及具体机制。本论文以岷县当归根饮片为原料,沿用课题组已建立的工艺,采用水提醇沉法提取得到当归多糖并通过一系列手段进行质量评价。体内建立T2DM、NAFLD和AFLD小鼠模型,体外建立胰岛素抵抗细胞模型、脂肪变性细胞模型和酒精性脂肪肝细胞模型,并用当归多糖对小鼠灌胃治疗或与细胞共培养,通过一系列手段评价当归多糖的治疗效果并研究分子机制。本课题不仅明确了当归多糖治疗代谢综合征相关疾病的作用和具体机制,为其临床应用奠定理论基础;还为代谢综合征的药物治疗提供更多依据,对提高人民生活质量起到积极作用,并有助于祖国医药的传承与发扬。第一部分当归多糖的提取、纯化与鉴定制备当归多糖沿用本实验室已建立并优化过的工艺:首先采用水提醇沉法提取当归粗多糖,之后依次用反复冻融除杂,用0.8 μm和0.45 ltm微孔滤膜除杂,Mw 3500透析袋除杂,再放入真空冷冻干燥机直至出现白色絮状当归多糖。随后采用葡聚糖凝胶G50色谱分离柱分离提纯得到精制当归多糖。对提取的当归多糖进行结构鉴定和质量控制:硫酸苯酚法测得当归多糖糖含量大于90%,HPGPC法测得当归多糖重均分子量为72900Da,紫外扫描显示当归多糖中几乎不含核酸和蛋白质,红外扫描明确了多糖的特征吸收峰,单糖分析表明当归多糖主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,比例为1:2.5:7.5。该部分实验证明提取的当归多糖纯度高、分子量均一、几乎不含杂质;实验易于重复,条件可控,结果稳定,提取的当归多糖可用于后续药理学研究。第二部分当归多糖治疗T2DM的作用及机制研究我国T2DM患者众多,严重影响人民健康水平,而目前临床上治疗糖尿病化学药物大都靶点单一,副作用明显。而当归多糖毒副作用小,药理作用强,本部分研究旨在明确当归多糖对T2DM的治疗作用,为当归多糖的临床应用提供理论依据。我们在研究中利用高热量饮食长期喂养小鼠,外加注射链脲佐菌素(STZ)破坏胰岛β细胞建立T2DM小鼠模型,再用当归多糖灌胃治疗四周。实验中定期监测小鼠体重和空腹血糖浓度(FBG);治疗结束后进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT),检测小鼠肝重指数、糖化血红蛋白(HbA1c)含量、血清TC、血清TG、血清HDL-c、血清LDL-c、血清ALT、血清AST和肝糖原含量;检测血清胰岛素、葡糖激酶(GK)和葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)水平;制作组织切片,观察胰岛H&E染色切片和肝脏油红O染色切片;WB法检测小鼠肝脏胰岛素通路相关蛋白IRS-2、PI3K、Akt、p-Akt和GLUT2。另外,为明确当归多糖对胰岛素通路的刺激作用,我们还建立胰岛素抵抗HepG2细胞模型,当归多糖培养后检测细胞中p-IRβ、p-IRS1、p-IPI3K和p-Akt含量,观察当归多糖对胰岛素通路的调控作用。实验过程中,T2DM小鼠出现“三多一少”的症状,即多饮、多尿、多食和体重减轻。当归多糖对减少的体重没有影响,但是可以降低T2DM小鼠升高的肝重指数。T2DM小鼠FBG和HbA1c明显升高,超过11.1mmol/L,葡萄糖耐受力显著降低;当归多糖治疗后T2DM小鼠血糖显著降低,葡萄糖耐受力明显提升。此外,T2DM小鼠出现了明显的血脂紊乱和肝损伤(ALT和AST水平提高),当归多糖可以明显调控这些生物标志物更趋于正常水平。组织学观察表明T2DM小鼠胰岛严重损坏,当归多糖可适度修复胰岛;肝脏油红O切片显示T2DM小鼠肝脏有大量脂肪堆积,同样,当归多糖可适度缓解脂肪肝。值得注意的是,当归多糖可以大幅度提高小鼠血清胰岛素水平,提示我们当归多糖可能对胰岛素通路有独特的作用。WB法检测小鼠肝脏胰岛素通路相关蛋白,结果表明当归多糖可显著提高通路关键蛋白的表达量,提示当归多糖可能对胰岛素通路有刺激作用,从而发挥降血糖作用。为进一步明确该作用,我们建立胰岛素抵抗细胞模型并用当归多糖干预培养;当归多糖介入后,细胞中胰岛素通路关键蛋白可明显上调,而PI3K抑制剂LY294002可以抵消当归多糖的这一作用,再次证明当归多糖可上调胰岛素通路。另一方面,当归多糖可提高小鼠肝糖原含量,并上调糖原合成酶关键酶GK,提示我们当归多糖的降血糖作用跟其调控糖原合成也有一定关系,进一步机制有待研究。该部分实验证明当归多糖能显著缓解T2DM小鼠的高血糖、高血脂以及肝损伤。当归多糖的降糖效果跟其刺激胰岛素分泌、提高肝脏胰岛素通路敏感性、提高肝糖原含量有关。本部分实验中发现当归多糖对肝脏脂肪堆积有显著的缓解作用,为后文当归多糖治疗NAFLD/AFLD的研究奠定基础。第三部分当归多糖治疗NAFLD的作用及机制研究随着生活水平的提高和运动的缺乏,我国NAFLD患病率急剧上升,严重影响公众健康。但是目前临床上NAFLD的药物治疗领域还是空白,本部分实验旨在明确当归多糖对NAFLD的治疗作用,并明确具体机制,为NAFLD的临床用药提供更多依据和新的可能。本部分研究中,我们采用用高脂高糖饲料喂食小鼠长达三个月,模拟NAFLD人群不健康的饮食习惯,建立动物模型;当归多糖治疗一个月后处死小鼠,检测相关指标,明确当归多糖的药理作用。跟第二部分类似,本部分研究中定期监测小鼠体重和空腹血糖浓度(FBG);实验最后阶段进行口服葡萄糖耐量测试(OGTT);处死小鼠后检测肝重指数、血清及肝脏TC、血清及肝脏TG、血清HDL-c/血清LDL-c、血清ALT和血清AST含量;检测血清胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数;检测小鼠肝脏胰岛素通路相关蛋白,观察当归多糖对NAFLD小鼠肝脏胰岛素通路的调控作用;检测肝糖原含量,以及糖代谢相关酶葡糖激酶(GK)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、丙酮酸激酶(PK)和已糖激酶(HK)的含量;化学法检测肝脏或血清抗氧化系统相关指标超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)和过氧化氢酶(CAT)的含量;WB法检测肝脏跟脂质代谢相关蛋白PPARy、AMPK、p-AMPK和SIRT1的含量;此外,还探索性地检测了肝脏中细胞自噬相关蛋白LC3B的变化。为进一步明确当归多糖对脂质代谢的调控作用,我们还采用油酸诱导建立脂肪变性HepG2细胞模型,当归多糖干预培养,检测当归多糖的降脂效果,并用WB法检测LC3B和自噬上游调控分子AMPK的含量,明确当归多糖调控细胞自噬和降脂的作用。NAFLD的形成过程公认为“二次打击”假说,即以单纯脂肪变性为主的“第一次打击”和以氧化应激为主的“第二次打击”。我们的实验结果表明,模型小鼠血清脂质代谢物水平和肝脏脂肪含量均出现异常,肝脏油红O染色切片和H&E染色切片进一步证实了 NAFLD小鼠肝脏遭受的“第一次打击”,模型小鼠肝脏出现大量细胞空泡和脂质堆积,而当归多糖对这些异常指标均有显著的逆转作用,提示当归多糖可有效缓解“第一次打击”,当归多糖的降脂效果跟提高脂质代谢关键蛋白PPARγ、SIRT1和AMPK有关。通过检测氧化应激压力标志物ROS和MDA,以及抗氧化酶SOD、GSH、GSH-PX和CAT,我们发现NAFLD小鼠肝脏遭受严重的氧化应激压力;同样,当归多糖可显著提高NAFLD小鼠肝脏抗氧化能力,清除活性氧,缓解“第二次打击”。此外,胰岛素抵抗也是NAFLD的始动因子;实验中NAFLD小鼠抵抗素抵抗指数明显高于正常小鼠,而当归多糖可显著降低小鼠胰岛素抵抗指数,缓解胰岛素抵抗。根据第二部分的研究基础,我们推测当归多糖也可以刺激NAFLD小鼠肝脏胰岛素通路,实验结果显示当归多糖可提高胰岛素关键蛋白 IRβ、p:IRS1、IRS1、IRS2、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、membrane-GLUT2、GSK-3β含量,降低胰岛素通路负性调节因子p-JNK的含量,证明当归多糖通过刺激NAFLD小鼠胰岛素信号通路来缓解胰岛素抵抗。长期食用高热量饲料导致小鼠葡萄糖代谢紊乱,FBG和HbA1c升高、葡萄糖耐量下降、肝糖原含量降低、葡萄糖代谢酶水平异常,当归多糖可以或多或少地改善这些非正常水平的糖代谢相关指标。此外,最新研究表明激活细胞自噬可有效改善NAFLD;我们检测肝脏自噬关键蛋白LC3-I和LC3-Ⅱ的含量,结果表明NAFLD小鼠肝脏自噬水平显著降低,当归多糖可明显提高LC3-Ⅱ表达量,增强肝脏自噬。我们在体外实验中也证实了当归多糖对肝细胞自噬的激活作用,并且发现这一作用跟其激活自噬上游调节因子AMPK有关。总而言之,本部分研究证实了当归多糖通过缓解“二次打击”有效治疗NAFLD。当归多糖的降脂作用可能跟激活SIRT1-AMPK通路及肝细胞自噬有关。此外,当归多糖激活胰岛素通路,缓解胰岛素抵抗,促进葡萄糖吸收,加速肝糖原合成,从而有效改善葡萄糖代谢紊乱。本部分研究明确了当归多糖对NAFLD的治疗作用,为NAFLD的药物治疗提供新的思路。另外,在本部分实验中,我们发现当归多糖能促进自噬,为下一部分的机制研究奠定基础。第四部分当归多糖防治AFLD的作用及机制研究本部分研究承接第三部分继续探讨当归多糖对脂肪肝的治疗作用。目前我国人民生活水平不断提高,酒类产品消耗量逐年递增,AFLD已成为导致肝病的第二大因素。但是,目前尚无AFLD的药物治疗方法;因此,开发能缓解甚至治疗AFLD的药物迫在眉睫。我们通过连续灌胃大剂量高度白酒建立AFLD小鼠模型,期间灌胃当归多糖干预,观察当归多糖的防治作用。每天监测小鼠体重;处死小鼠后计算肝指数;收集血清和肝脏,检测血清TG、ALT和AST水平,肝脏TG和GSH含量。制作肝脏H&E染色切片和油红0染色切片观察肝脏脂肪变性和脂肪堆积,制作肝脏PAS染色切片观察肝糖原分布,制作肝脏透射电镜切片观察肝脏自噬体。RT-PCR法检测肝脏LC3B、ATG3和p62的mRNA水平,WB法检测肝脏LC3B和p62的蛋白含量。另一方面,体外建立酒精性HepG2细胞脂肪肝模型,并用当归多糖干预培养,油红O染色和油红O比色法观察当归多糖的体外降脂效果;流式细胞法检测细胞内活性氧(ROS)水平,JC-1法检测细胞内线粒体膜电位(MMP),免疫荧光法和WB法检测细胞内LC3B含量。此外,结合溶酶体抑制剂氯喹(CQ),或者用表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒瞬时转染HepG2细胞,检测或观察当归多糖对细胞内自噬流的影响。AFLD小鼠体重下降明显,肝指数没有变化,血清和肝脏TG水平显著提高,油红O染色显示AFLD小鼠肝脏脂肪堆积严重;当归多糖不能改善小鼠下降的体重,但是对脂肪肝的治疗效果十分显著,治疗后的小鼠肝脏切片跟正常小鼠没有差异。同时,AFLD小鼠血清ALT和AST大幅上升,肝损伤严重,当归多糖可显著缓解肝损伤。透射电镜观察发现当归多糖治疗后的小鼠肝脏有大量紧靠着脂滴的自噬体,提示小鼠肝脏可能发生有“噬脂”作用。检测自噬相关蛋白LC3B、ATG3和p62的mRNA或蛋白水平,证实当归多糖可显著提升AFLD小鼠肝脏自噬水平。体外实验中,当归多糖可显著缓解酒精引起的脂肪堆积、ROS累积以及异常的线粒体膜电位。另一方面,当归多糖可显著上调HepG2细胞自噬水平和自噬流,增加自噬溶酶体数量。综上所述,当归多糖能够有效治疗酒精引起的脂肪肝、肝损伤和脂代谢紊乱,其显著的降脂作用可能跟促进肝细胞自噬、上调自噬流和“噬脂”作用有关。但是,AFLD发病机制复杂,当归多糖的治疗作用可能不仅仅与调节自噬有关,更全面的作用机制还有待研究。总的来讲,当归多糖能够有效治疗代谢综合征类相关疾病,降低血糖血脂,缓解胰岛素抵抗,促进细胞自噬。本论文的研究为当归多糖的临床应用提供了充足的理论依据和研究基础,当归多糖有望被开发成适合人体服用的制剂,用以提高人民健康水平,并将祖国传统医药发扬光大。