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第一部分基于高通量RNA-Sequence技术和生物信息学方法筛选胃癌组织及对应癌旁正常组织的差异基因ITGA5目的:筛选胃癌组织及对应癌旁正常组织显著表达的整合素家族(Integrins)差异基因,探讨差异基因可能参与的生物学过程及影响的信号通路。方法:采用Illumina HiSeqTM 2500高通量测序技术对收集到的10对胃癌组织(T组)和对应癌旁正常组织(N组)样本进行mRNA深度测序,分析并筛选出差异基因。应用生物信息学方法分析差异表达的基因可能参与的生物学过程及信号通路,使用cluster-Profiler进行功能富集分析。通过GEPIA平台软件和starbase平台中山大学网公共数据库验证显著差异表达的基因,并应用Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)富集分析其参与的生物学过程及信号通路。结果:1.在N组和T组中鉴定出2625个差异mRNA,其中上调基因2307个,下调基因318个。其中整合素(ITGs)家族中ITG(A1、A5、A7、A10、AX、B1、B3、B5、B8)显著差异表达,其中ITGA5的Log|Fold Chang|差异倍数最高。2.GEPIA平台软件和starbase平台中山大学网公共数据库发现ITGA5在胃癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织;ITGA5基因表达与胃癌患者预后因素相关,ITGA5高表达患者预后较差,ITGA5低表达患者预后较好。3.基于高通量测序数据,对显著差异表达整合素和ITGA5基因进行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析,进一步GSEA富集分析,发现显著差异表达整合素及ITGA5参与的信号通路主要富集在Focal adhesion、ECM-receptor interaction及PI3K-AKT等相关通路上,主要参与蛋白连接、细胞粘附、粘着斑、细胞基质受体相互作用等生物学过程。结论:筛选到差异基因ITGA5,其主要参与蛋白连接、细胞粘附、粘着斑、细胞基质受体相互作用等生物学过程,可能参与Focal adhesion、ECM-receptor interaction、PI3K-AKT等信号通路,但需进一步实验验证。第二部分ITGA5基因在胃癌组织和细胞中的表达及其与患者临床病理特征的相关性研究目的:检测整合素α5(integrinα5,ITGA5)在胃癌组织和胃癌细胞中的表达情况,并分析其与临床病理特征的相关性。方法:1、收集胃癌患者组织标本及临床资料,提取组织中总RNA和总蛋白,并制作组织蜡块。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术、Western Blot技术、免疫荧光技术(immunofluorescence technique,IF)和免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测ITGA5在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达水平;2、收集胃粘膜细胞(GES-1)和胃癌细胞系细胞(AGS、MKN-28、和HGC-27),提取总RNA和总蛋白,应用qRT-PCR和Western Blot技术检测细胞系中ITGA5表达水平。计量资料用均数±标准差((?)±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验。计数资料使用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.胃癌组织和癌旁正常组织的Western blot和qRT-PCR检测结果显示:与癌旁正常组织相比,ITGA5在胃癌患者组织中的蛋白表达水平显著升高,而mRNA水平与蛋白表达水平相一致,均有显著性差异(P<0.05)。2.免疫组化结果显示:ITGA5基因在患者肿瘤组织中显著升高,并与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM病理分期显著相关(P<0.05),而与年龄、性别及组织学分型相关性不显著(P>0.05)。3.ITGA5在qRT-PCR检测结果显示,与正常胃黏膜细胞Ges-1相比,ITGA5在胃癌细胞系(AGS、MKN-28和HGC-27)中的表达水平显著升高(P<0.05),Western blot检测结果与qRT-PCR结果趋势一致,且AGS和MKN-28细胞中表达水平相对较高(P<0.05)。选择这两株细胞用于后续实验。结论:1.ITGA5在胃癌组织中表达水平显著升高,而在癌旁正常组织中低表达。2.ITGA5表达水平与患者肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期显著相关(P<0.05),而与患者性别、年龄及组织学分型相关性不显著。3.与正常胃粘膜细胞(Ges-1)相比ITGA5在胃癌细胞系(AGS、MKN-28、和HGC-27)中表达水平显著升高。第三部分ITGA5基因对体内外胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响目的:体内外实验探究ITGA5基因对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。方法:由广州富能生物科技公司构建合成sh-NC、sh-ITGA5-1、sh-ITGA5-2、sh-ITGA5-3和OE-ITGA5质粒,通过感受态细胞转化,挑选单克隆菌株,扩大培养,抽提质粒,用Lipofectamine 3000转染MKN-28和AGS胃癌细胞,通过qRT-PCR和Western blot验证筛选质粒,选择其沉默效率最优者用于下一步实验。根据筛选的质粒,用第三代慢病毒包装体系、293T工具细胞、Lipofectamine 3000进行慢病毒包装,纯化后感染胃癌细胞,用嘌呤霉素进行筛选,构建沉默和过表达的稳定转染胃癌细胞株,在此基础上通过CCK8、Edu和克隆形成检测胃癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测胃癌细胞的凋亡率,Transwell小室实验检测胃癌细胞的迁移能力,Transwell小室涂抹基质胶检测胃癌细胞的侵袭能力。MKN-28和AGS细胞稳定转染沉默及过表达ITGA5基因后,行裸鼠皮下移植瘤种植,测量移植瘤体积及重量,活体成像仪扫描裸鼠,免疫组织化学检测ITGA5表达。所有计量资料用均数±标准差((?)±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验。计数资料使用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:qRT-PCR检测结果显示sh-ITGA5-1沉默效果最好,过表达ITGA5基因后,与对照组相比,MKN-28和AGS胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著增强(均P<0.05)。沉默ITGA5基因后,与对照组相比,MKN-28和AGS胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著降低(均P<0.05)。但过表达及沉默ITGA5基因后,胃癌细胞的凋亡率无显著差异(P<0.05)。体内实验发现,过表达ITGA5基因可加快裸鼠移植瘤的增殖(P<0.05);沉默ITGA5基因后,裸鼠移植瘤生长则减慢(P<0.05)。结论:ITGA5基因可促进胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,而对凋亡无影响。第四部分筛选调控ITGA5表达的miRNA并进行靶向验证目的:筛选调控ITGA5表达的miRNA,探究其在胃癌细胞中与ITGA5基因的靶向调控关系。方法:通过Target Scan、miRDB、miRTar Base和mir DIP等在线软件预测靶向ITGA5的miRNA,应用qRT-PCR和Western blot进一步验证,采用生物信息学筛选与ITGA5呈负相关,并可能存在靶向关系的miRNA进行双荧光素酶报告基因实验。构建ITGA5 3’-UTR野生型(Wt)质粒和突变型(Mut)质粒,应用双荧光素酶报告基因实验,在293T细胞中共转染miRNA mimics模拟物与ITGA5 Wt/Mut质粒,检测荧光强度。通过ENCORI Pan-cancer Analysis Platform中山大学公共数据库,分析ITGA5与miRNA在胃癌组织样本中的相关性。所有计量资料用均数±标准差((?)±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验。计数资料使用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:在常见的四个在线靶向预测软件中最终筛选出6个稳定性和保守性较高的miRNA(miR-26a-5p、miR-92a-3p、miR-148a-3p、miR-148b-3p、miR-330-5p和miR-152-3p),qRT-PCR和Western blot验证结果显示,仅转染miR-330-5p mimics后ITGA5表达水平显著下调(P<0.05),miR-330-5p与ITGA5表达水平呈负相关,双荧光素酶报告基因实验结果显示,与共转染miR mimics-NC和ITGA5-Wt组相比,miR-330-5p mimics和ITGA5-Wt组的相对荧光值显著降低(P<0.05);与共转染miR mimics-NC和ITGA5-Mut组相比,miR-330-5p mimics和ITGA5-Mut组的相对荧光值无显著改变(P>0.05)。结论:miR-330-5p可能是ITGA5的上游调控分子,双荧光素酶报告实验验证了该结论。第五部分miR-330-5p介导ITGA5影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力及调控机制研究目的:探究miR-330-5p调控介导ITGA5影响胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的能力及相关信号通路调控机制。方法:转染miR-330-5p mimics,miR-330-5p inhibitors,sh-ITGA5,OE-ITGA5;共转染miR-330-5p mimics和OE-ITGA5,miR-330-5p inhibitors和sh-ITGA5后,应用CCK8、Edu和克隆形成实验检测miR-330-5p和ITGA5对胃癌细胞增殖能力的影响;应用Transwell小室检测miR-330-5p和ITGA5对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响。应用Western blot检测各组中ITGA5、FAK、p-FAK、AKT、p-AKT蛋白表达水平。所有计量资料用均数±标准差((?)±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验。计数资料使用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:在MKN-28和AGS细胞中,与对照组相比,miR-330-5p mimics可显著抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移(P<0.05);OE-ITGA5可显著促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移(P<0.05);共转染miR-330-5p mimics和OE-ITGA5后,miR-330-5p mimics可显著逆转OE-ITGA5对胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力的促进作用(P<0.05)。Western blot检测结果显示,在MKN-28和AGS细胞中,(1)沉默ITGA5基因后,与Control组和阴性对照组相比,磷酸化的p-FAK和p-AKT表达显著下调(P<0.05),但FAK和AKT无显著改变。与之相反,过表达ITGA5基因后,与Control组和阴性对照组相比,磷酸化的p-FAK和p-AKT表达显著上调(P<0.05),但FAK和AKT无显著改变。(2)与miR mimics NC组相比,miR-330-5p mimics组ITGA5、p-FAK和p-AKT蛋白表达水平显著受到抑制(P<0.05),而FAK和AKT蛋白水平的表达无显著改变。OE-ITGA5+miR mimics NC组ITGA5、p-FAK和p-AKT蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而FAK和AKT蛋白水平的表达无显著改变。与OE-ITGA5+miR mimics NC组相比,OE-ITGA5+miR-330-5p mimics组ITGA5、p-FAK和p-AKT蛋白表达水平显著升高同时受到miR-330-5p mimics的显著抑制(P<0.05);FAK和AKT蛋白水平的表达无显著改变。(3)与miR inhibitors NC组相比,miR-330-5p inhibitors组ITGA5、p-FAK和p-AKT蛋白表达水平显著上调((P<0.05),而FAK和AKT蛋白水平的表达无显著改变。sh-ITGA5+miR inhibitors NC组ITGA5、p-FAK和p-AKT蛋白表达水平显著受到抑制(P<0.05),而FAK和AKT蛋白水平的表达无显著改变。与sh-ITGA5+miR inhibitors NC组相比,sh-ITGA5+miR-330-5p inhibitors组p-FAK和p-AKT蛋白表达水平显著降低同时受到miR-330-5p inhibitors显著促进(P<0.05),FAK和AKT蛋白水平的表达无显著改变。结论:miR-330-5p介导ITGA5影响胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制可能与调控FAK/AKT信号通路有关。