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研究目的：利用原子力显微镜研究肝癌侵袭能力与细胞骨架力学重塑的关系,探明肝癌侵袭过程中的力学特性。并探讨NRP1基因对肝癌细胞的原子力学特性的影响。研究方法：1.杨氏模量及骨架重塑对肝癌细胞侵袭的影响(1)以不同侵袭能力肝癌细胞系(MHCC-97H细胞、MHCC-97L细胞、SMMC-7721细胞、Huh-7细胞)为研究对象,通过原子力显微镜对各细胞进行表面形态扫描,分别对各细胞的胞质区和胞核区的杨氏模量进行测量。(2)以不同侵袭能力肝癌细胞系(MHCC-97H细胞、MHCC-97L细胞、SMMC-7721细胞、Huh-7细胞)为研究对象,采用免疫荧光染色法对细胞骨架微丝F-Actin进行荧光染色,对荧光染色结果进行拍摄并探讨不同侵袭能力肝癌细胞细胞骨架重塑特性(3)以不同侵袭能力肝癌细胞系(MHCC-97H细胞、MHCC-97L细胞、SMMC-7721细胞、Huh-7细胞)为研究对象,利用细胞划痕实验对四株肝癌细胞的迁移能力进行测定,并探讨细胞迁移能力与细胞力学参数(杨氏模量)的关系。2.NRP1基因对肝癌细胞力学参数的影响(1)以肝癌细胞(MHCC-97H细胞、HCCLM3细胞)为研究对象,制备NRP1基因沉默肝癌细胞(MHCC97H-shNRP1细胞、HCCLM3-shNRP1细胞)及其空白对照组(MHCC97H-NC细胞、HCCLM3-NC细胞),通过原子力显微镜对单个细胞进行表面形态扫描,得到单个细胞的细胞高度图(Height),偏折图(Error Signal)和3D图(3D),观察细胞表面形态并分别测量胞质区和胞核区的平均粗糙度。(2)以肝癌细胞(MHCC-97H细胞、HCCLM3细胞)为研究对象,制备NRP1基因沉默肝癌细胞(MHCC97H-shNRP1细胞、HCCLM3-shNRP1细胞)及其空白对照组(MHCC97H-NC细胞、HCCLM3-NC细胞),通过原子力显微镜对单个细胞的杨氏模量进行测量。(3)以肝癌细胞(MHCC-97H细胞、HCCLM3细胞)为研究对象,制备NRP1基因沉默肝癌细胞(MHCC97H-shNRP1细胞、HCCLM3-shNRP1细胞)及其空白对照组(MHCC97H-NC细胞、HCCLM3-NC细胞),通过原子力显微镜对单个细胞的粘弹力(以Residual RMS进行描述)进行测量。3.统计学方法定量资料采用IBM SPSS 21进行正态性检验,非正态性分布资料以“中位数(Median)和上、下分位数间距(25%,75%)”表示,两组独立样本比较采用Wilcoxon秩和检验,多个独立样本间采用Kruskal-Wallis H检验。检验水准α=0.05。正态性分布资料以“均值(mean)±标准差(SD)”表示,使用t检验,单因素方差分析进行比较,检验水准α=0.05。实验结果：1.杨氏模量及骨架重塑对肝癌细胞侵袭的影响(1)按细胞侵袭力由低至高排序细胞株胞质区杨氏模量(Pa)测量结果(Median(25%,75%))分别为：Huh-7细胞为1608.43(845.48,3317.25),SMMC-7721细胞为1055.28(367.48,2280.77),MHCC-97L细胞为1026.78(369.20,2019.96),MHCC-97H细胞为503.12(366.11,700.31),由此可见,随着细胞侵袭能力增强,细胞胞质区杨氏模量逐渐降低(P<0.01)；按细胞侵袭力由低至高排序细胞株胞核区杨氏模量(Pa)测量结果(Median (25%,75%))分别为：Huh-7细胞为2823.98(1262.78,4440.07),SMMC-7721细胞为1313.43(590.71,2678.62),MHCC-97L细胞为1285.17(583.29,1961.19),MHCC-97H细胞为655.57(441.29,943.39),由此可见,随着细胞侵袭能力增强,细胞胞核区杨氏模量逐渐降低(P<0.01)；同时同种肝癌细胞的胞核区的杨氏模量高于胞质区。(2)镜下可见随着细胞侵袭能力增强,细胞骨架完整性越差,微丝分布越紊乱,且近胞核区域较胞质区远端更加致密。其中侵袭能力最弱的Huh-7细胞细胞骨架规则完整,侵袭能力第3的SMMC-7721细胞微丝完整性和规律性下降,侵袭能力第2的MHCC-97L细胞微丝不完整、分布紊乱,而侵袭能力最强的MHCC-97H细胞更是出现微丝断裂扭曲的现象。(3)划痕实验中MHCC-97H细胞24h迁移率为46.67%、48h迁移率为86.47%,MHCC-97L细胞24h迁移率为45.70%、48h迁移率为82.86%,SMMC-7721细胞24h迁移率为39.41%、48h迁移率为79.85%,Huh-7细胞24h迁移率为34.60%、48h迁移率为72.09%,表现出了按照MHCC-97H、MHCC-97L、 SMMC-7721、Huh-7的顺序逐渐降低的趋势。2.NRP1基因对肝癌细胞力学参数的影响(1)MHCC97H-NC细胞的高度大约为5.5μm,表面粗糙不均,其细胞质区平均粗糙度为283.25±31.26nm,而细胞核区的平均粗糙度为382.78±78.10nm。MHCC97H-shNRP1细胞高度约为4.5μm,表面粗糙不均,其细胞质区平均粗糙度为30.23±7.17 nm,而细胞核区的平均粗糙度为271.75±74.59 nm。经NRP1基因沉默的MHCC97H-shNRP1细胞具有相对平滑的膜表面；HCCLM3-NC细胞的高度大约为6.5μm,表面粗糙不均,其细胞质区平均粗糙度为147.95±15.53nm,而细胞核区的平均粗糙度为315.83±57.55nm。HCCLM3-shNRP1细胞高度约为5.7μm,表面粗糙不均,其细胞质区平均粗糙度为16.03±2.18nm,而细胞核区的平均粗糙度为135.70±29.69nm。经NRP1基因沉默的HCCLM3-shNRP1细胞具有相对平滑的膜表面。(2)MHCC97H-NC细胞杨氏模量为3888.91±110.17Pa,MHCC97H-shNRPl细胞杨氏模量为4687.06±123.03 Pa。经沉默NRP1基因处理的细胞杨氏模量明显上升(P<0.01)；HCCLM3-NC细胞杨氏模量为1982.01±66.13 Pa,HCCLM3-shNRP1细胞杨氏模量为2863.61±55.27 Pa。经沉默NRP1基因处理的细胞杨氏模量明显上升(P<0.01)。(3) MHCC97H-NC细胞粘弹力为81.55±2.53 pN, MHCC97H-shNRP1细胞粘弹力为65.61±2.41 pN。经沉默NRP1基因处理的细胞粘弹力明显下降(P<0.05)；HCCLM3-NC细胞粘弹力为123.18±2.90 pN,HCCLM3-shNRP1细胞粘弹力为97.89士3.56 pN。经沉默NRP1基因处理的细胞粘弹力明显下降(P<0.01)。结论：侵袭能力越强的肝癌细胞杨氏模量越低,细胞越软,形变能力越强；同时,细胞骨架完整性越差,结构越趋于紊乱,反之亦然。经NRP1基因沉默后的肝癌细胞细胞胞膜表面粗糙度明显降低。经NRP1基因沉默的肝癌细胞杨氏模量明显升高且粘弹力显著降低。细胞的杨氏模量及粘弹力可能提示肿瘤的恶性程度,杨氏模量越低、粘弹力越高,形变能力越强,肿瘤细胞的侵袭能力越高,肿瘤细胞细胞骨架的破坏和／或重塑影响其转移潜能,其生物力学性质的改变标志着其转移潜能的大小,因此可以作为监测癌症侵袭能力及复发预后的新指标。