细胞色素c是一类在生物体中广泛分布的血红素蛋白,由亚铁血红素(heme)和细胞色素c蛋白前体(apocyt c)在细胞色素c成熟系统的作用下共价结合形成。细胞色素c主要作为电子载体或者氧化还原酶参与细胞的能量传递过程,如呼吸作用和光合作用。以Shewanella oneidensis为代表的Shewanella属细菌的标志是呼吸多样性,这大部分归功于其含量极其丰富的细胞色素c。本论文在本实验室前期工作的基础上,继续深入研究S. oneidensis硝酸和亚硝酸呼吸的分子基础,在两个方面取得了重要的成果：一是确定了为硝酸和亚硝酸还原酶传递电子的替代性醌醇氧化酶；二是阐明了亚硝酸还原酶成熟的独特机制。S. oneidensis采用以位于细胞内膜上的细胞色素c CymA为中枢的发散式电子传递网络,CymA将电子从醌库传递到各个呼吸通路的末端还原酶。然而,CymA的缺失造成多种电子受体(EAs)呼吸能力的减弱而非完全丧失,暗示无氧呼吸通路存在CymA的功能替代物。为了寻找该替代物,本研究采用转座子构建随机突变库的方法,在ΔcymA的背景下筛选硝酸和亚硝酸呼吸能力进一步减弱的突变株。共获得87株,转座子插入位置分析显示,细胞色素bcl复合体可能是CymA在硝酸和亚硝酸呼吸通路中的替代物。进一步研究发现泛醌(UQ)和甲基萘醌(MK)都可以为CymA和细胞色素bc1提供电子,但具有一定的偏好性。细胞色素bc1缺失突变株硝酸和亚硝酸呼吸能力比野生型更强,这种改变不是通过提高cymA表达水平或改变醌库组成来实现的,而可能是由于细胞色素bcl缺失打破了电子分配的平衡,造成了流向CymA的电子流强度的增加。此外,在研究细胞色素bcl的表达调控时,我们发现其表达受氧气而非硝酸和亚硝酸的诱导,同时受到全局调控因子Crp和ArcA的间接调控。细胞色素c蛋白的亚铁血红素结合位点(heme binding motifs, HBMs)包括两种：典型和非典型。已有的研究表明典型HBM的成熟由细胞色素c蛋白成熟系统(cytochrome c maturation, Ccm)承担,而非典型HBM由特异成熟系统完成。S. oneidensis亚硝酸还原酶NrfA拥有4个典型HBMs和1个非典型HBM,但缺乏特异成熟系统。本论文研究揭示在该菌中虽然典型HBM的成熟仍由Ccm系统独立完成,但NrfA上非典型HBM的成熟也完全依赖于Ccm系统,不再需要特异成熟系统。体内和体外实验证明S.oneidensis细胞色素c蛋白这一独特成熟模式的分子基础是CcmⅠ。CcmⅠ蛋白由跨膜不可溶部分(CcmⅠ-1)和位于周质空间的可溶部分(CcmI-2)组成,在典型HBM成熟过程中重要但非必需,而在NrfA非典型HBM的成熟中完全必需。具体是,CcmⅠ-1功能区独立承担典型HBM的成熟过程,CcmI-2部分可有可无；NrfA非典型HBM的成熟则需要完整的CcmⅠ,两部分缺一不可。深入的机制研究表明CcmⅠ-2与NrfA存在直接相互作用,推测CcmⅠ-2在NrfA成熟过程中发挥分子伴侣功能,负责向HBM成熟催化中心特异性传递NrfA。与之相反,NrfA成熟对CcmⅠ-1的依赖则缺乏特异性,其功能主要是保证典型HBM成熟的高效完成,从而防止NrfA蛋白前体的迅速降解。综上所述,本研究一是发现了S. oneidensis拥有CymA的替补呼吸蛋白一细胞色素bc1,解析了其电子传递通路的特点和表达调控机制,完善了S.oneidensis的呼吸网络。二是首次发现了Ccm系统中关键蛋白CcmⅠ在细胞色素c典型和非典型HBMs成熟过程中功能各异,从分子机制上阐明了拥有典型和非典型HBMs的亚硝酸还原酶NrfA的成熟机制。