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脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)可引起猪和多种哺乳动物脑炎与心肌炎,具有重要公共卫生学意义。EMCV2C非结构蛋白参与病毒诱导的自噬反应,但其是否具有拮抗先天性免疫应答作用尚不清楚。本研究构建了 EMCV所有非结构蛋白真核表达质粒,通过体外转染,观察了 IFN-β信号通路分子的变化,丰富了 EMCV致病机制。另外,利用反向遗传技术构建了能够表达PCV2ORF2基因的重组EMCV rNJ08/Cap毒株,为探索EMCV活病毒载体寻找合适位点表达外源基因奠定了理论基础。具体内容如下:1.I型干扰素信号通路重要分子的克隆与表达本研究以MDA5、RIG I、VISA、IRF3、P65和IKKβ等IFN-β信号通路分子基因序列为模板,设计引物进行RT-PCR扩增,扩增产物克隆至pCAGGS真核表达载体上,经过双酶切及测序鉴定后成功获得上述重组质粒。通过脂质体转染法将质粒转染293A细胞后,western blot实验结果表明,不同免疫分子能在此真核系统下有效表达,表达产物分子量大小与预期相符,为探究EMCV非结构蛋白参与对抗宿主先天性免疫应答的机制奠定了重要基础。2.脑心肌炎病毒2C蛋白对IFN-β信号通路的影响本研究以EMCVNJ08cDNA感染性克隆质粒为模板,设计引物,通过PCR等方法构建了 EMCV所有非结构蛋白真核表达质粒,分别命名为pCAGGS-YY-Flag(YY:2A、2B、2C、3A、3C、3D)。将上述质粒分别转染293A细胞,双荧光素酶报告基因试验结果显示,2C蛋白具有抑制IFN-β启动子的活性。Real-time PCR结果表明,与阴性对照组相比,2C蛋白组中MDA5、RIGI、IFN-β、MX1、ISG56、ISG15及OAS的mRNA相对表达量均表现出明显下降。定位实验结果显示,2C蛋白通过与MDA5或RIG I相互作用而抑制了 IFN-β产生,并且此抑制作用与MDA5关系密切。免疫共沉淀试验结果表明,2C蛋白与MDA5在293A细胞内存在互作关系。2C蛋白截短体试验结果发现,2C蛋白N端1-31位氨基酸为抑制IFN-β产生的活性区域。本研究丰富了 EMCV逃逸先天性免疫应答的作用机制。3.表达猪圆环病毒2型ORF2基因的重组脑心肌炎病毒的构建与鉴定本研究采用EMCVNJ08毒株感染性克隆质粒pCMV-rNJ08,利用PCR等方法将PCV2 ORF2基因成功引入EMCV L蛋白基因第6位及第7位氧基酸之间,获得感染性重组质粒pCMV-rNJ08/Cap。将质粒转染BHK-21细胞后,拯救获得重组病毒rNJ08/Cap。拯救病毒含有分子遗传标记。Western Blot和IFA结果显示,该重组病毒成功表达Cap蛋白。将拯救病毒rNJ08/Cap进行连续传代,生长曲线和病毒蚀斑试验结果表明各代病毒生长特性与亲本病毒基本一致。证明EMCV可以作为表达外源基因的病毒载体,为PCV2和EMCV疫苗研究奠定了重要基础。