论文部分内容阅读
目的:本实验基于“肾脑相济”理论,建立围绝经期抑郁症大鼠模型,观察电针疗法对围绝经期抑郁症大鼠行为学和神经细胞形态结构的变化,研究海马神经干细胞数量、增殖分化及蛋白表达的情况,探讨Wnt信号通路与神经再生之间的相关性,为临床针灸治疗围绝经期抑郁症提供理论依据。材料与方法:1动物及分组选用雌性SD大鼠50只,SPF级,采用随机数字表法随机分为空白组、模型组、假手术组、西药组及电针组,每组10只。所有动物进入实验室后给予适应性饲养21天。实验过程中,动物的处置需符合《关于善待实验动物的指导性意见》规定。2造模方法依据国际公认的造模方法,选择去势法（OVX）联合慢性不可预见性刺激法（CUMS）建立围绝经期抑郁症大鼠模型。空白组不作处理;假手术组仅拉出卵巢而不进行结扎切除,只将卵巢旁的脂肪组织切除;模型组、西药组和电针组进行双侧卵巢切除手术。围绝经期造模成功后,采用改良P.Willner的慢性不可预见性刺激造模方法复制抑郁症模型。每天随机选择1种刺激,连续2天不能给予同种刺激。3干预方法空白组:大鼠给予正常饲养,不接受任何刺激。模型组:抓取大鼠用布袋包覆固定20分钟,不予治疗。假手术组:抓取大鼠用布袋包覆固定20分钟,不予治疗。西药组:使用盐酸氯米帕明片,将药片碾碎后溶于0.9%生理盐水,按20 mg/kg·d-1用量灌胃,每日1次,连续28天。电针组:电针治疗选择“百会”、双侧“肾俞”和双侧“三阴交”,穴位定位参照《实验针灸学》。肾俞位于大鼠背部,第二腰椎下旁开5mm之两旁肋间,直刺6mm;三阴交位于大鼠后肢,内踝尖直上10mm,直刺5mm;百会位于大鼠顶骨正中,平刺2mm;大鼠用布袋包覆固定并针刺后,连接电针仪,两对电极接大鼠同侧三阴交及肾俞,第三对电极正极接鼠尾,负极接百会,电极（负载250Ω）018 V,疏密波型,疏波频率为4Hz,密波频率为20Hz,通电强度以局部皮肤肌肉轻微颤动为准,留针20分钟,每日1次,连续28天。4指标检测及方法造模前、造模后和治疗后,观察大鼠的一般情况及动情周期,检测大鼠的行为学变化,包括体质量实验、旷场实验、糖水偏嗜实验和悬尾实验;尼氏染色方法观察海马CA3区神经细胞的形态结构变化;免疫组化方法测定海马区巢蛋白（Nestin）、微管蛋白（Tuj-1）、星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及少突胶质细胞特异性半乳糖脑苷脂（GALC）标记的阳性细胞所占的百分率;免疫荧光方法观察神经干细胞的增殖及分化情况;ELISA方法检测Nestin、GFAP、Tuj-1及GALC蛋白含量;ELISA方法检测海马区Wnt信号通路相关蛋白Dickkopf 1（DDK1）、低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP-5）及低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP-6）含量,Western blot方法检测海马区β-catenin蛋白表达情况。结果:1一般情况造模前,各组大鼠一般状况良好。造模后,大鼠一般状况明显变差,精神萎靡、四肢无力、蜷缩俯卧、闭眼少动、食欲下降、皮毛干枯。治疗后,西药组和电针组大鼠一般情况好转,精神状态变好,皮毛恢复光泽,行动能力变强,饮食尚可,排泄佳。造模前,各组大鼠体质量无明显差异,无统计学意义（P>0.05）;造模后,除空白组外,其余各组大鼠体质量明显下降（P<0.05）;经过治疗后,与模型组相比,西药组和电针组大鼠体质量明显上升（P<0.05）。结果表明,电针治疗后大鼠的食欲增加,摄食量增多,机体的整体状态良好。2行为学检测2.1旷场实验造模前,各组大鼠3分钟中央格停留时间和运动距离无明显差异,无统计学意义（P>0.05）;造模后,与空白组相比,其余各组大鼠3分钟中央格停留时间和运动距离降低（P<0.05）;治疗后,与模型组相比,西药组和电针组大鼠在3分钟中央格停留时间和运动距离明显延长（P<0.05）。结果表明,电针治疗后大鼠3分钟中央格停留时间和运动距离增加,探究行为增加,紧张度降低,行为无助的现象减少。2.2糖水偏嗜实验造模前,各组大鼠的糖水偏嗜度均处于较高水平,无统计学意义（P>0.05）;造模后,与空白组相比,其余各组大鼠的糖水偏嗜度明显下降（P<0.05）;治疗后,与模型组相比,西药组和电针组大鼠的糖水偏嗜度明显增加（P<0.05）;西药组和电针组相比,大鼠的糖水偏嗜度相似,差异无统计学意义（P>0.05）。结果表明,电针治疗后大鼠的糖水偏嗜度增加,快感缺失现象得到缓解。2.3悬尾实验造模前,各组大鼠的悬尾不动时间无明显差异,无统计学意义（P>0.05）。造模后,与空白组相比,其余各组大鼠的悬尾不动时间明显增加,行为绝望状态出现时间明显增加（P<0.05）;治疗后,与模型组相比,西药组和电针组大鼠的悬尾不动时间减少,行为绝望状态出现时间明显减少（P<0.05）。结果表明,电针治疗后大鼠的绝望状态减轻。3形态学指标观察及检测3.1海马CA3区尼氏染色尼氏染色显示,光镜下空白组大鼠海马神经元胞质内含有丰富的尼氏体,呈紫蓝色,细胞排列整齐规则,神经元结构完整,胞质及胞核染色均匀、清晰,形态正常。造模后,模型组大鼠海马区神经元结构明显破坏,细胞的数量减少,细胞的间隙增大,排列疏松不齐,层次明显变稀,细胞层中断,细胞核消失,细胞质萎缩,部分细胞脱落出现空洞,轴突和树突的结构不完整,甚至细胞结构完全消失。假手术组、西药组和电针组,大鼠海马的神经细胞形态改变介于空白组和模型组之间,结构基本完整。治疗后,西药组和电针组海马区神经元的数量增多,细胞的结构有所恢复,海马的神经细胞形态学改变得到明显改善。3.2免疫组化法检测Nestin阳性细胞率与空白组相比,模型组Nestin阳性细胞的表达率明显升高,有显著的统计学意义（P<0.01）;经过治疗后,西药组和电针组Nestin阳性细胞的表达率有所升高,与模型组和假手术组相比,有显著的统计学意义（P<0.01）。结果表明,电针治疗后Nestin阳性细胞的数量增加。3.3免疫组化法检测Tuj-1阳性细胞率与空白组相比,模型组Tuj-1阳性细胞的表达率明显降低,有显著的统计学意义（P<0.01）;经过治疗后,西药组和电针组Tuj-1阳性细胞的表达率明显升高,与模型组相比,有显著的统计学意义（P<0.01）。结果表明,电针治疗后Tuj-1阳性细胞的数量增加。3.4免疫组化法检测GFAP阳性细胞率与空白组相比,模型组GFAP阳性细胞的表达率明显降低,有显著的统计学意义（P<0.01）;经过治疗后,西药组和电针组GFAP阳性细胞的表达率明显升高,与模型组相比,有显著的统计学意义（P<0.01）。结果表明,电针治疗后GFAP阳性细胞的数量增加。3.5免疫组化法检测GALC阳性细胞表达率与空白组相比,模型组GALC阳性细胞的表达率明显升高,有显著的统计学意义（P<0.01）;经过治疗后,西药组和电针组GALC阳性细胞的表达率明显升高,有显著的统计学意义（P<0.01）。结果表明,电针治疗后GALC阳性细胞的数量增加。3.6免疫荧光法观察神经干细胞增殖情况实验中,空白组、模型组、假手术组、西药组和电针组海马区都有Brdu/Nestin共表达阳性细胞,表明围绝经期抑郁症大鼠海马区增殖细胞中存在神经干细胞。Brdu注射后7天后,模型组Brdu/Nestin荧光双标应激反应性增高,电针组Brdu/Nestin荧光双标减少;Brdu注射14天和28天后,模型组Brdu/Nestin荧光双标开始逐渐减少,电针组Brdu/Nestin荧光双标增加。结果表明,电针治疗可促进神经干细胞增殖。3.7免疫荧光法观察神经干细胞分化情况实验中,空白组、模型组、假手术组、西药组和电针组海马区均有Nestin/Tuj-1共表达阳性细胞。与空白组比较,模型组大鼠Nestin/Tuj-1荧光双标数目减少;与模型组比较,西药组和电针组大鼠Nestin/Tuj-1荧光双标数目明显增多。结果表明,电针治疗可促进神经干细胞向神经元分化。实验中,空白组、模型组、假手术组、西药组和电针组海马区均有Nestin/GFAP共表达阳性细胞。与空白组比较,模型组大鼠Nestin/GFAP荧光双标数目减少;与模型组比较,西药组和电针组大鼠Nestin/GFAP荧光双标数目明显增多。结果表明,电针治疗可促进神经干细胞向成熟星形胶质细胞分化。实验中,空白组、模型组、假手术组、西药组和电针组海马区都有Nestin/GALC共表达阳性细胞。与空白组比较,模型组大鼠Nestin/GALC荧光双标数目减少;与模型组比较,西药组和电针组大鼠Nestin/GALC荧光双标数目增多。结果表明,电针治疗可促进神经干细胞向少突胶质细胞分化。4分子生物学指标检测4.1 ELISA方法检测电针对海马区DKK1、LRP-5和LRP-6蛋白的影响与空白组相比,模型组DKK1表达明显降低,LRP-5和LRP-6表达升高,差异有统计学意义（P<0.05）。经过治疗后,药物组和电针组DKK1表达升高,LRP-5和LRP-6表达降低。与模型组比较,差异有统计学意义（P<0.05）。4.2 ELISA方法检测电针对海马区Nestin、GFAP、Tuj-1及GALC蛋白表达的影响与空白组相比,模型组Nestin蛋白含量明显增加,有统计学意义（P<0.05）;经过治疗后,西药组和电针组Nestin蛋白含量有所下降,与模型组和假手术组相比,有统计学意义（P<0.05）。与空白组相比,模型组GFAP蛋白含量减少,Tuj-1和GALC蛋白含量增加,有统计学意义（P<0.05）;经过治疗后,西药组和电针组GFAP和Tuj-1蛋白含量减少,GALC蛋白含量增加,与模型组相比,有统计学意义（P<0.05）。4.3 Western blot方法检测电针对海马区β-catenin含量与空白组相比,模型组β-catenin蛋白表达量明显升高,有统计学意义（P<0.01）;治疗后,西药组和电针组β-catenin蛋白表达量降低,有统计学意义（P<0.05）。结果表明,电针治疗通过调节β-catenin蛋白影响Wnt信号通路。结论:1电针“百会”、“肾俞”及“三阴交”能有效改善围绝经期抑郁症大鼠模型的行为学指标。2电针“百会”、“肾俞”及“三阴交”能调整海马CA3区神经元细胞的数量和结构,为神经干细胞的增殖及分化提供形态学基础。3电针“百会”、“肾俞”及“三阴交”能增加围绝经期抑郁症大鼠模型海马区神经干细胞数目增加,促进神经干细胞增殖,且向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化。4电针“百会”、“肾俞”及“三阴交”对围绝经期抑郁症大鼠模型的作用可能与Wnt信号通路的调整作用有关。5“肾脑相济”电针疗法对围绝经期抑郁症的干预可能通过Wnt/β-catenin介导的神经干细胞增殖和分化起到抗抑郁作用。