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1研究目的本课题组前期研究发现来源于一氧化氮合酶基因（eNOS）第四内含子27个碱基重复序列（定义为“27nt-miRNA”）以增强子的方式抑制eNOS基因表达和血管NO产物,并参与VSMC表型转换的调控,故而推测27nt-miRNA可能参与调控VSMC其他关键功能。本研究以自噬和凋亡功能为切入点初步探索内皮源性27nt-miRNA对人主动脉血管平滑肌细胞的调控作用,预测并验证27nt-miRNA参与调控人主动脉VSMC自噬-凋亡交互应答的潜在靶基因,以期为动脉粥样硬化疾病药物治疗分子化提供理论基础及其潜在治疗靶点。2实验方法2.1 27nt-miRNA慢病毒载体转染VSMC根据实验要求,将人主动脉VSMC随机分四组:正常对照组、pre-27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组、阴性对照（miR-NC）组。正常对照组的VSMC不给于任何处理,其余三组分别转染pre-27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA、miR-NC慢病毒载体。转染完成后采用流式细胞术检测GFP绿色荧光表达情况,RT-qPCR法检测转染前后27nt-miRNA表达水平差异,两者结合验证转染是否成功。2.2检测各组VSMC自噬水平与分子调控水平根据实验要求,采用厄尔平衡盐溶液（EBSS）诱导细胞自噬,将VSMC随机分五组:正常对照组、EBSS 组、pre-27nt-miRNA 组、anti-27nt-miRNA组和miR-NC组,除正常对照组外,其余组别均给予EBSS（1×）培养6h诱导自噬。透射电镜观察各组细胞自噬小体超微结构;Lyso-tracker Red染色法观察各组细胞自噬溶酶体;RT-qPCR法检测LC3B、Beclin-1和p62的mRNA表达水平;免疫印迹实验（Westernblot）法检测LC3B、Beclin-1和p62蛋白表达量。2.3检测各组VSMC凋亡水平及分子调控水平根据实验要求,将VSMC随机分五组:正常对照组、EBSS组（凋亡诱导模型）、pre-27nt-miRNA 组、anti-27nt-miRNA 组和 miR-NC 组,除正常对照组外,其余组均给予EBSS（1×）培养24h诱导凋亡。CCK-8法检测各组细胞活力与增殖能力;流式细胞术检测各组细胞分裂周期比例（PI单染法）及细胞凋亡率（Annexin V-APC/7-AAD双染法）;RT-qPCR法检测Bcl-2、Bax 和 caspase-3 的 mRNA 水平;Westernblot 法检测 Bcl-2、Bax 和 caspase-3蛋白表达量。2.4预测并验证27nt-miRNA潜在靶基因首先在miRBase、miRDB和TargetScan7.2生物学信息数据库预测27nt-miRNA靶基因,根据GO、KEGG和HRPD数据库进行筛选。如若数据库中不能检索,则根据文献调研及前期实验基础选定潜在靶基因进行验证。在靶基因抑制剂作用下,采用RT-qPCR法和Western blot法初步验证潜在靶基因功能表达水平。根据荧光素酶活性报告基因系统实验要求,构建含有靶基因3’UTR野生型（wt）和突变型（mut）的基因报告质粒及pmirGLO对照质粒载体,以及27nt-miRNA过表达和阴性对照质粒,先转染miRNA质粒（分别含过表达和阴性对照序列）,再分别转染靶基因报告质粒和pmirGLO载体质粒。转染48h后裂解细胞,分别检测萤火虫萤光素酶（LCU1）和海肾荧光素酶（LCU2）活性,计算LCU1/LCU2比值并分析。3 实验结果3.1 27nt-miRNA慢病毒载体转染VSMC可调节其表达水平以感染指数MOI=80转染VSMC,转染后细胞基本表达GFP绿色荧光,经嘌呤霉素筛选后细胞表达绿色荧光比例可达90%。RT-qPCR结果显示转染后,pre-27nt-miRNA组miRNA表达水平较转染前升高近三倍（P<0.05）,而anti-27nt-miRNA的miRNA表达水平较转染前显著降低（P<0.05）,miR-NC组与正常对照组无显著性差异,说明转染慢病毒载体可在不同程度调节27nt-miRNA表达水平。3.2 27nt-miRNA过表达促进EBSS诱导的VSMC自噬在细胞自噬检测结果中,正常对照组细胞偶见自噬小体,自噬溶酶体红色荧光较弱;而EBSS组可见较多自噬小体,自噬溶酶体红色荧光较正常对照组强烈（P<0.05）,miR-NC组表现与之无显著差异;而pre-27nt-miRNA组的自噬小体与自噬溶酶体生成情况均多于miR-NC组（P<0.05）;上述两个指标中anti-27nt-miRNA均弱于miR-NC组（P<0.05）,与miR-NC无组间差异。在基因转录水平与蛋白表达水平检测中,与正常对照组比较,EBSS组LC3B和Beclin-1的mRNA和蛋白表达量均升高,p62的mRNA和蛋白表达量均降低（P<0.05）;而 pre-27nt-miRNA 组的 LC3B 和 Beclin-1 的 mRNA和蛋白表达量较EBSS组升高,p62则呈降低趋势（P<0.05）。anti-27nt-miRNA组与miR-NC组的组间差异亦有统计学意义（P<0.05）。3.3 27nt-miRNA过表达抑制EBSS诱导的VSMC凋亡在细胞凋亡检测结果中,与正常对照组比较,EBSS诱导VSMC凋亡后,EBSS组与miR-NC组的细胞活性显著降低,细胞周期阻滞在G1期,细胞凋亡率显著升高（P<0.05）,且EBSS组与miR-NC组的上述指标无组间差异。与miR-NC组比较,pre-27nt-miRNA组的细胞活性、细胞周期S期、G2期比例均升高,细胞凋亡率显著降低（P<0.05）;anti-27nt-miRNA组的细胞活性降低,细胞周期阻滞在G1期且比例升高,且细胞凋亡率升高（P<0.05）。在基因转录水平与蛋白表达水平检测中,与正常对照组比较,EBSS组Bax和caspase-3的mRNA和蛋白表达量均升高但Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著降低（P<0.05）,其与miR-NC组无显著性差异。与miR-NC组比较,pre-27nt-miRNA组的Bax和caspase-3的mRNA和蛋白表达量降低但Bcl-2的mRNA和蛋白表达量显著升高（P<0.05）;anti-27nt-miRNA组Bcl-2的mRNA与蛋白表达量显著降低而caspase-3的mRNA与蛋白表达量显著升高（P<0.05）。3.4 27nt-miRNA靶向抑制mTOR表达调控VSMC自噬-凋亡交互应答在 miRBase、miRDB 和 TargetScan7.2 数据库发现:27nt-miRNA 并未收录在内,但在基因功能数据库检索及文献调研后发现,27nt-miRNA与mTOR的3’-UTR存在潜在结合位点。进一步实验验证了在mTOR抑制剂雷帕霉素作用下27nt-miRNA过表达显著抑制mRNA表达水平及mTOR蛋白磷酸化程度（P<0.05）。在双荧光素酶活性报告基因系统检测结果显示,过表达27nt-miRNA可以抑制携带野生型mTOR-3’UTR序列载体的萤火虫荧光素酶活性,但对携带mTOR-3’UTR突变序列的载体的萤火虫荧光素酶活性无影响,证实了 27nt-miRNA可与mTOR-3’UTR靶向结合。上述结果均提示27nt-miRNA可能通过靶向抑制mTOR磷酸化对VSMC自噬-凋亡交互应答起调控作用。4 结论4.1 27nt-miRNA过表达可促进EBSS诱导的VSMC自噬,使细胞内自噬小体与自噬溶酶体生成量增加,通过增加LC3B和Beclin-1的mRNA和蛋白表达水平并下调p62表达调控细胞自噬。4.2 27nt-miRNA过表达可抑制EBSS诱导的VSMC凋亡,增强细胞活性并减弱G1细胞周期的阻滞效应,降低细胞凋亡率,且可通过抑制Bax和caspase-3并激活Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平调控细胞凋亡。4.3 通过验证初步可知27nt-miRNA靶向结合mTOR-3’UTR种子区域,通过抑制mTOR信号因子mRNA表达水平和蛋白磷酸化表达水平参与调控VSMC自噬-凋亡交互应答。