研究目的:氯吡苯脲（CPPU）是一种新型的高效植物生长调节剂,被广泛应用于蔬菜、粮食作物、果树等,少量接触对人体危害并不大,但长期大量使用后对使用人群的潜在影响并不明确。因此,针对氯吡苯脲进行动态残留研究和毒理学评价,建立快速残留检测方法和安全性评价体系,推动生长调节剂的合理应用具有重要意义。本论文以猕猴桃为例,旨在研究氯吡苯脲在猕猴桃生长期和物流贮藏期间的残留动态,考察猕猴桃生长期氯吡苯脲的降解情况,并研究物流贮藏期的不同处理方法、不同贮藏天数和不同温度下的残留量变化。同时通过小鼠单次毒性试验,确定小鼠给予氯吡苯脲的LD₅₀及95%可信限。采用大鼠重复毒性试验,分析氯吡苯脲对动物的毒理学指标影响,确定重复毒性无毒性反应剂量（NOAEL）,并评价毒性靶器官和恢复情况。通过幼龄大鼠和成年大鼠给予氯吡苯脲后,研究氯吡苯脲在不同年龄动物体内的毒性暴露规律。同时,试验也考察了亲代毒性剂量下氯吡苯脲对子代幼龄动物生殖发育的影响。本研究可以完善有效的氯吡苯脲残留监控体系,阐明生长调节剂的危害性和毒理学影响,明确氯吡苯脲在猕猴桃中的暴露风险和安全浓度,以便对这种生长调节剂的合理使用提供理论指导。研究方法:1.氯吡苯脲的残留动态研究1.1氯吡苯脲残留分析方法学建立本试验采用LC-MS/MS法检测猕猴桃中的氯吡苯脲浓度,其中色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×50 mm,1.7μm）。流动相为:0.1%甲酸水-乙腈溶液（0.00-1.80 min:40︰60→90︰10,1.80-2.50 min:90︰10,2.50-3.00 min:90︰10→40︰60,3.00-4.00 min:40︰60）V/V。流速为0.3 m L/min,柱温为35℃,进样量为5μL。采用MRM检测模式,离子源参数为Capillary voltage:3.50 k V;Source Temp:150℃;Desolvation Temp:400℃;Collision Gas Flow:0.15 m L/min;Cone Gas Flow:50 L/Hr;Desolvation Gas Flow:700 L/Hr。氯吡苯脲检测参数为母离子m/z:248.02;子离子m/z:93.07,裂解电压:22.0V,碰撞能量:36 e V。样本采用Qu ECh ERS分散固相萃取试剂进行净化处理。分别考察了专属性,标准曲线与定量范围,定量限,精密度和准确度,提取回收率,基质效应,稀释可靠性和残留。1.2猕猴桃中氯吡苯脲的残留检测（1）通过LC-MS/MS方法考察喷洒不同浓度（5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L）氯吡苯脲后猕猴桃中氯吡苯脲的残留情况。（2）考察猕猴桃生长期间氯吡苯脲的残留量及降解情况（3）考察物流贮藏期间,经0.05 mmol乙烯（Eth）处理的猕猴桃中氯吡苯脲的残留改变;不同贮藏时间（0 d,15 d,30 d,60 d,90 d,120 d）猕猴桃中氯吡苯脲残留降解模式;不同贮藏温度下（2～8℃,-25～-15℃）猕猴桃中氯吡苯脲的残留动态。2.氯吡苯脲的非临床安全性评价2.1.小鼠单次给药毒性评价取检疫合格小鼠60只,按体重随机分为6组,每组10只,雌雄各半,分为溶媒对照组和5个受试组,受试组灌胃剂量为1500 mg/kg/day、1350 mg/kg/day、1215 mg/kg/day、1094 mg/kg/day和985 mg/kg/day。单次灌胃给予相应浓度的受试液,容量为0.4 m L/10 g,溶媒对照组给予等容积的0.5%CMC-Na溶液。给药后连续观察7天,记录动物外观、行为活动、精神状态、食欲、大小便及其颜色、皮毛、鼻、眼、口有无异常分泌物以及死亡情况,并计算小鼠灌胃单次毒性LD₅₀及95%可信限。2.2.大鼠重复给药毒性评价选择检疫合格大鼠80只,雌雄各半。随机分为高剂量组（600 mg/kg/day）、中剂量组（300 mg/kg/day）、低剂量组（150 mg/kg/day）和溶媒对照组。各组大鼠每天灌胃给予相应浓度的药液一次,给药容积为10 m L/kg,溶媒对照组给予等容积0.5%CMC-Na溶液。每天对大鼠给药过程及给药后进行观察,观察内容包括体征外观,行为,尿粪情况,毛色、眼口周围及鼻分泌物,观察大鼠的反应、姿势、呼吸状态等是否异常。每周称量体重两次,每周称取48小时内摄食量一次。给药一个月后将每组10只动物麻醉;恢复期后将每组10只动物麻醉。动物麻醉后,腹主动脉采血,将相应的全血、血浆及血清进行血液学,生化及凝血功能检测。动物采血处死后,进行大体解剖检查,肉眼检查主要脏器的异常病变,并称重计算大鼠脏器系数。剥离出股骨,采用涂片法制成骨髓涂片进行骨髓检查。溶媒对照组和氯吡苯脲600 mg/kg/day组及尸检异常动物脏器常规取材、石蜡包埋、切片和HE染色,进行组织病理学检查。2.3.氯吡苯脲对幼龄大鼠生殖系统发育的毒性研究选择检疫合格大鼠10～12周龄,饲养一段时间后进行雌雄交配,雌鼠妊娠第15天开始给予氯吡苯脲300 mg/kg/day,至F1代离乳（PND21）结束亲代动物给药。选择离乳幼龄大鼠64只,体重45～55 g,雌雄各半,随机分成4组,分为高剂量组（300 mg/kg/day）、中剂量组（100 mg/kg/day）、低剂量组（30 mg/kg/day）和溶媒对照组,每组16只。各组大鼠PND21后每天灌胃给予相应浓度的药液,给药容积为10 m L/kg,溶媒对照组给予等容积的0.5%CMC-Na溶液,每天给药一次,连续给药4周。每日观察体征外观和行为情况,尿粪特征,毛色、眼口周围及鼻分泌物等。观察给药期间及给药后的动物的毒性反应、呼吸情况、姿势等是否异常。每周称量二次。雌性大鼠阴道涂片观察发情周期变化情况。给药2周、3周、4周及停药4周后,称重剖杀,每组4只,雌雄各半。麻醉采血,进行大体解剖检查,肉眼观察主要脏器是否发生异常改变,取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、垂体、子宫、卵巢（睾丸、附睾、前列腺）、下丘脑后称重计算脏器系数,血液需检测生化血液指标,雄性动物检测精子运动活力和精子运动方式。血清检测雄鼠睾酮T、雌鼠雌二醇E2、黄体生成素LH、促卵泡激素FSH、孕激素P浓度。给药结束后雌鼠子宫和雄鼠睾丸作病理切片,并测量子宫壁厚度。考察氯吡苯脲对幼龄大鼠生殖系统发育的影响。2.4.氯吡苯脲在不同年龄动物中的毒性暴露研究2.4.1.氯吡苯脲血浆生物分析方法学建立本试验采用LC-MS/MS检测大鼠血浆中的氯吡苯脲浓度,其中色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×50 mm,1.7μm）。流动相为:0.1%甲酸水-乙腈溶液（0.00-2.00 min:90︰10→5︰95,2.00-3.50 min:5︰95,3.50-4.00 min:5︰95→90︰10,4.00-5.00 min:90︰10）V/V。流速为0.3 m L/min,柱温为30℃,进样量为7μL。采用MRM检测模式,离子源参数为Capillary voltage:3.00 k V;Source Temp:400℃;Desolvation Temp:350℃;Collision Gas Flow:0.15 m L/min;Cone Gas Flow:50 L/Hr;Desolvation Gas Flow:800 L/Hr。氯吡苯脲检测参数为母离子m/z:248.02;子离子m/z:93.07,裂解电压:22.0V,碰撞能量:36.0 e V。选择姜黄素为内标,其检测参数为母离子m/z:369.09;子离子m/z:176.99,裂解电压:27.0 V,碰撞能量:22.0 e V。样本采用3倍量甲醇溶液（含100 ng/m L姜黄素内标液）进行蛋白沉淀处理。分别考察了特异性,标准曲线与定量范围,定量限,精密度和准确度,基质效应,提取回收率,稳定性,稀释可靠性和残留。2.4.2.不同年龄动物的氯吡苯脲毒性暴露研究选择检疫合格SD大鼠60只,随机分成6组,每组10只,即成年动物（180～230g）低、中、高剂量组,幼龄动物（90～130 g）低、中、高剂量组。低、中、高剂量分别为150、300和600 mg/kg/day。于灌胃给药前及给药后15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、8 h、24 h、48 h剪尾采血。血浆样品采用经验证的LC-MS/MS分析方法检测血浆中氯吡苯脲的浓度。所有的测定数据都由Mass Lynx软件采集并处理,用Microsoft Exce L计算和处理数据。用DAS 3.0软件选择统计矩法进行动力学参数计算,血药浓度达峰时间T_max及峰浓度C_max为实测值。毒性暴露相关参数包括AUC_（0-t）、C_max、T_max等,比较成年动物与幼龄动物毒性暴露差异。3.氯吡苯脲的摄入风险评估基于毒理学及相关动物实验结果获得的NOAEL,根据《农药每日允许摄入量制定指南》建议的不确定系数（安全系数,UF）推导得到氯吡苯脲每日允许摄入量（ADI）。再按照《中国居民膳食指南》推荐的每日可食用水果量350 g计算得到氯吡苯脲摄入暴露量（EDI）,最终获得暴露风险值和氯吡苯脲在水果中的安全浓度,根据试验中检测的氯吡苯脲残留量来评估风险。研究结果:1.氯吡苯脲的残留动态研究1.1氯吡苯脲残留分析方法学建立本试验采用LC-MS/MS检测猕猴桃中的氯吡苯脲,猕猴桃基质对氯吡苯脲检测无干扰。氯吡苯脲标准曲线相关系数（r）大于0.99（r=0.997195）,定量范围为0.5～500 ng/m L。氯吡苯脲质控样品（0.8、40、400 ng/m L）的批内精密度介于1.25%～2.61%之间,批间精密度在2.94%～8.58%之间,批内准确度在-4.17%～2.61%之间,批间准确度偏差在-7.44%～2.29%之间。提取回收率在93.52%～99.69%之间。基质效应在86.09%～91.33%之间。氯吡苯脲在稀释50倍条件下可靠性良好,样本检测残留符合要求。1.2猕猴桃中氯吡苯脲的残留检测（1）考察猕猴桃生长期间,施药90天后的氯吡苯脲残留量及降解率。猕猴桃喷洒0,5.0,10.0,20.0,50.0 mg/L浓度的氯吡苯脲后,施药当天氯吡苯脲的残留量浓度最高到11562μg/kg,但在经过90 d生长后猕猴桃果皮中已降解到13.1～92.1μg/kg,降解率大于98.6%;果肉中降解到3.0～20.4μg/kg,降解率大于99.6%。（2）考察物流贮藏期间,经乙烯（Eth）处理后的猕猴桃中氯吡苯脲残留量变化。经0.05 mmol/L Eth处理后,在相同贮藏天数下猕猴桃果皮中氯吡苯脲含量均发生下降,不同浓度喷洒的氯吡苯脲降解率7.4%～61.8%,而果肉中氯吡苯脲含量有所上升,上升率8.3%～66.7%,贮藏30 d后果肉中氯吡苯脲含量已低于23μg/kg。（3）考察物流贮藏期间,不同贮藏时间（0 d,15 d,30 d,60 d,90 d,120 d）猕猴桃中氯吡苯脲残留动态。随着贮藏时间增加,氯吡苯脲残留量逐渐下降,至120 d后果皮中贮藏降解率达47.3%～89.3%,果肉中贮藏降解率达35.4%～74.3%,贮藏过程中氯吡苯脲残留量以一级反应动力学方式逐渐降解。（4）考察物流贮藏期间,不同贮藏温度下（2～8℃,-25～-15℃）猕猴桃中氯吡苯脲的残留变化。随着贮藏温度的降低,氯吡苯脲的残留消除速度减慢。在相同贮藏天数下温度越低残留降解越少。2.氯吡苯脲的非临床安全性评价2.1.小鼠单次给药毒性评价氯吡苯脲1500 mg/kg、1350 mg/kg、1215 mg/kg、1094 mg/kg和985 mg/kg组动物灌胃后出现的异常反应主要为自主活动减少,呼吸困难,腹式呼吸,呼吸暂停,震颤,俯卧,翻正反射消失,阵挛性抽搐等。存活动物在两个小时内即可恢复正常。1094 mg/kg以上氯吡苯脲给药后出现死亡,大部分动物的死亡时间在给药后3 h内。死亡小鼠经解剖后发现动物胃、肠道部分有弥散和条状出血,胃肠扩张,内有大量透明液体,胃壁浆膜层见出血,肠道暗红色。受试组动物的体重存在先下降后上升的趋势,各氯吡苯脲受试动物的体重与溶媒对照组相比较略有下降,但无显著性差异（P﹥0.05）。小鼠灌胃给以氯吡苯脲1500 mg/kg、1350 mg/kg、1215 mg/kg、1094 mg/kg和985 mg/kg的死亡率分别为100%、90%、60%、40%和0%,经Bliss法计算得LD₅₀值为1164.7 mg/kg,其95%可信限为1102.6～1230.3mg/kg。2.2.大鼠重复毒性安全评价SD大鼠给予氯吡苯脲4周后,停药第1天与溶媒对照组相比,氯吡苯脲300mg/kg及以上剂量组雄性大鼠的Bun和CREA明显升高（P<0.05）,600 mg/kg/day剂量组GLU升高（P<0.05）。氯吡苯脲300 mg/kg及以上剂量组雌雄大鼠的肾脏系数显著升高（P<0.05）,氯吡苯脲300 mg/kg剂量组雌性动物肝脏系数显著升高（P<0.01）。病理切片检查可见肾脏的病理组织学改变,主要表现为轻度肾管萎缩,明显的白细胞管型、透明管型、间质炎性细胞浸润、肾小管扩张。停药4周,毒性反应症状有所恢复。表明SD大鼠连续灌胃给予氯吡苯脲4周,在300 mg/kg/day剂量下为较轻微的肾脏毒性反应,主要毒性靶器官为肾脏,在150 mg/kg/day剂量下未见明显毒性反应。2.3.氯吡苯脲对幼龄大鼠生殖系统发育的毒性研究试验期间,各给药组未见脏器系数、雌鼠子宫和雄鼠睾丸病理组织、雌鼠子宫壁厚度、雄性动物精子活力改变。高剂量组（300 mg/kg/day）大鼠均出现轻度脱毛现象,停药后可逐渐恢复。氯吡苯脲300 mg/kg/day雌性大鼠给药4周后平均体重明显降低（P<0.01）,经4周恢复后略有回升。300 mg/kg/day剂量给药3周后,雄鼠Bun、CREA和GLU均出现显著升高（P<0.05）,该异常情况在给药4周后仍未消除,直至恢复期结束基本恢复正常。300 mg/kg/day剂量给药4周后雌鼠Bun指标显著升高（P<0.05）,恢复期结束可恢复。雌性动物给药后动情周期略有提前,高剂量组（300 mg/kg/day）可提前2～3天左右,阴道张开时间明显缩短（P<0.05）。血清检测结果显示给药4周后随剂量增加雌鼠雌二醇指标上升（P<0.001）。试验表明300 mg/kg剂量氯吡苯脲可影响幼龄大鼠动情周期及性激素水平。2.4.氯吡苯脲在不同年龄动物中的毒性暴露研究2.4.1氯吡苯脲血浆生物分析方法学建立本试验采用LC-MS/MS检测大鼠血浆中的氯吡苯脲,基质对氯吡苯脲和内标姜黄素检测无干扰。氯吡苯脲标准曲线相关系数（r）均大于0.98（r=0.9988）,定量范围均为20～2000 ng/m L。氯吡苯脲质控样品（60、1000、1600 ng/m L）的批内精密度在0.8%～2.5%之间,批间精密度在0.4%～1.8%之间,批内准确度在97.7%～107.5%之间,批间准确度在98.5%～107.8%之间。提取回收率在82.5%～93.1%之间。基质效应在90.5%～98.1%之间。氯吡苯脲血浆样品冰盒放置12小时、-15～-25℃放置14天,反复冻融3次及样品处理后自动进样器放置24 h均保持稳定。氯吡苯脲在稀释20倍条件下可靠性良好,样本检测残留符合要求。2.4.2不同年龄动物的氯吡苯脲毒性暴露研究SD大鼠单次灌胃给予氯吡苯脲后,成年大鼠和幼龄大鼠在150～600mg/kg/day剂量范围内SD大鼠体内氯吡苯脲的暴露量AUC_（0-t）和C_max均随剂量增加而增大。同性别幼龄大鼠与成年大鼠相比,给予150,300,600 mg/kg/day氯吡苯脲后体内的氯吡苯脲AUC_（0-t）、C_max有所增加,雌性动物AUC_（0-t）分别增加12.1%、25.2%、45.8%,雄性动物AUC_（0-t）分别增加16.0%、15.1%、42.5%;雌性动物C_max分别增加16.3%、23.5%、37.2%,雄性动物C_max暴露分别增加28.3%、42.2%、50.7%。3.氯吡苯脲的摄入风险评估经大鼠单次毒性、重复毒性、幼龄大鼠生殖系统发育及毒性暴露考察,初步推测氯吡苯脲未观察到有害作用剂量（NOAEL）为100 mg/kg。根据《农药每日允许摄入量制定指南》要求,不确定系数（安全系数,UF）一般为100,同时结合毒理学试验数据,从4周毒性试验外推到慢性毒性试验需放大10倍,最终得到不确定系数为1000,计算得到氯吡苯脲每日允许摄入量（ADI）为0.10 mg/kg。按照《中国居民膳食指南》推荐的每日可食用水果量350 g（成人体重60 kg）计算得到风险值Risk ratio为0.1%,该值远远低于100%,表明猕猴桃中氯吡苯脲具有良好的安全性。同时,氯吡苯脲在猕猴桃中的安全浓度为16.4 mg/kg,远远低于猕猴桃的氯吡苯脲残留量,表明经合理喷洒氯吡苯脲（5～50 mg/L）的猕猴桃经物流贮藏后食用安全。结论:猕猴桃在生长期经氯吡苯脲喷洒90天后果肉中降解率大于99.6%,有少量残留。随物流贮藏时间延长氯吡苯脲残留降解增加,贮藏温度越低降解越少。经乙烯处理后猕猴桃果肉中氯吡苯脲含量有所上升,但仍低于国标限值50μg/kg要求。经大鼠单次毒性、重复毒性、毒性暴露研究和生殖发育研究,推测氯吡苯脲NOAEL为100 mg/kg。计算得到氯吡苯脲每日允许摄入量（ADI）为0.15 mg/kg,风险值为0.1%,氯吡苯脲在猕猴桃中的安全浓度为16.4 mg/kg,猕猴桃的氯吡苯脲残留远远低于该值,表明氯吡苯脲具有较好的安全性。本研究可为氯吡苯脲的合理使用提供相关的科学依据,也完善了氯吡苯脲的毒理学资料。