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Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）因其胞外段与果蝇的Toll蛋白同源而得名，属于Ⅰ型跨膜受体，目前已成功克隆出11种人的TLRs和13种小鼠的TLRs。作为模式识别受体（Pattern-recognition receptors，PRRs）家族成员，TLRs主要识别病原微生物的“共性”成分—病原相关分子模式（Pathogen associated molecule pattern，PAMP），如TLR4主要识别革兰阴性细菌细胞外膜层的主要成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）及其具有保守类脂A结构的衍生物，TLR3主要识别病毒分子中的双链RNA。TLRs特异性结合自身配体后，通过髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor,MyD88）依赖性或非依赖性途径激活下游一系列蛋白级联反应，将刺激信号转导至细胞核内，导致核因子-κ3（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）、活化蛋白-1、干扰素调节因子等重要免疫基因转录因子的活化，诱导相应细胞因子如白细胞介素（Interleukin，IL）-1、-2、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及干扰素的合成与释放，并通过促进树突状细胞的成熟而启动获得性免疫反应，最终激发一系列针对不同病原微生物的免疫事件。研究认为，机体多种免疫防御反应均需要不同TLRs的参与。TLRs不仅构成机体抗感染免疫的“第一道防线”，在启动早期天然免疫应答中起重要作用，更成为联系天然免疫和获得性免疫的“桥梁”，对获得性免疫的发生和发生类型具有重要的调控作用。机体的免疫应答反应在疾病发生发展过程中常呈现“双刃剑”的作用。免疫应答反应不足，常易受感染而发病；免疫应答反应过度，又可遭至病情恶化，如脓毒血症的发病就是如此。调控免疫反应已是临床防治疾病的重要措施。已有证据表明，有的中药可以增强机体的免疫应答能力，有的则能抑制过度的免疫反应而达到治疗的目的。作为目前发现的识别PAMP的主要受体，TLRs在机体抗感染防御反应中的地位至关重要，中药对TLRs及其相关信号元件的作用和影响，理所当然地受到人们的重视。凡以解表药为主组成，具有发汗、解肌、透疹等作用，主治表证的方剂，称为解表剂，现代研究认为解表剂可治疗病毒感染性疾病。而以清热药为主组成，具有清热、消炎、凉血、解毒等作用，治疗里热证的方剂，称为清热剂，现代主要用于治疗细菌感染引起的发热、炎症等疾病。本实验选择临床应用广泛、疗效确切的辛温解表的桂枝汤、扶正解表的参苏饮、清热解毒的黄连解毒汤和清开灵作为受试药物，制备含药血清，以与天然免疫密切相关的肺巨噬细胞株RAW264.7为研究对象，分别在mRNA和蛋白质水平分析研究桂枝汤等4个组方对细菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、多聚肌苷酸多聚胞苷酸（Polyinosinic acid：polycytidilic acid，Poly（I：C））刺激下，RAW264.7细胞表达TLR3、TLR4及其下游主要信号转导元件MyD88、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（Tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF-6）、Toll样受体相关的干扰素活化子（TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β，TRIF）、Toll样受体相关分子（Toll-like receptor-associated molecule，TRAM）和相关基因诱导产物的影响。本实验同时研究了上述方剂中主要药味相关有效成份桂皮醛、人参皂苷Rg1、小檗碱和黄芩苷对TLR3、TLR4及其下游信号转导通路相关指标的影响，以期探讨解表、清热方剂及其相关成分对TLR3、TLR4及其下游信号转导通路的不同影响免疫学基础。现将实验结果简述如下：一、解表／清热方对LPS、Poly（I：C）刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α和IFN-β的影响分别以LPS(5μg·mL-1，下同)和Poly（I：C）(50μg·mL-1，下同)刺激RAW264.7细胞，以桂枝汤等4个组方不同浓度含药血清进行干预，ELISA法测定细胞培养上清液TNF-α和IFN-β的含量。结果表明，桂枝汤等4组方含药血清显著降低TNF-α、IFN-β的量，且呈较好的量一效关系；Logit法计算各方剂含药血清的IC50，确定各组方含药血清的实验剂量分别为：LPS刺激时，桂枝汤：4.2 g·kg-1·U-1；参苏饮：11.2和2.5g·kg-1·U-1；黄连解毒汤：2.4 g·kg-1·U-1；清开灵：1.9和0.6 g·kg-1·U-1。Poly（I：C）刺激时，桂枝汤：4.2 g·kg-1·U-1；参苏饮：4.8 g·kg-1·U-1；黄连解毒汤：6.0和2.9g·kg-1·U-1；清开灵：3.2和1.5 g·kg-1·U-1。二、解表／清热方剂对RAW264.7细胞TLR3、TLR4表达的影响分别以LPS和Poly（I：C）刺激RAW264.7细胞，以桂枝汤、参苏饮、黄连解毒汤和清开灵含药血清进行干预，分析LPS、Poly（I：C）的特异性受体TLR3、TLR4 mRNA及其蛋白表达情况。结果表明，Poly（I：C）刺激使RAW264.7细胞TLR3 mRNA表达明显增强（与空白对照组比较，P＜0.01），TLR4表达未见改变；而LPS刺激明显增加TLR4 mRNA表达（与空白对照组比较，P＜0.01），对TLR3 mRNA则无明显影响。LPS、Poly（I：C）刺激细胞后，TLR3、TLR4蛋白表达量也分别较刺激前显著增加，佐证了Poly（I：C）是TLR3特异性配体，LPS是TLR4特异性配体的认识。桂枝汤、参苏饮含药血清均显著降低TLR3 mRNA的高表达（与单纯Poly （I：C）刺激组比较，P＜0.01），对TLR4 mRNA的表达未显示出明显的降低作用；相反，黄连解毒汤、清开灵含药血清对TLR3 mRNA的表达无明显影响，但对TLR4的表达则表现出较强的抑制作用（与单纯LPS刺激组比较，P＜0.05或P＜0.01）。桂枝汤等4个组方对TLR3、TLR4蛋白表达的影响与对mRNA的结果基本一致，但抑制率有所差别。如桂枝汤、参苏饮含药血清对TLR3蛋白表达的抑制率为别为74.2％和55.3％，均较对mRNA的抑制率高，表明受试4组方对RAW264.7细胞受激惹后TLRs基因转录活性及其蛋白量的高表达，具有不同程度、明显的抑制活性。三、解表／清热方剂对RAW264.7细胞MyD88、TRAF-6表达的影响MyD88、TRAF-6是TLRs下游MyD88依赖信号转导途径的重要接头蛋白。研究表明，LPS、Poly（I：C）均诱导RAW264.7细胞MyD88 mRNA和蛋白的高表达（与空白对照组比较，P＜0.01），LPS还可诱导TRAF-6 mRNA、蛋白的升高。桂枝汤含药血清可显著降低LPS诱导的MyD88 mRNA和蛋白的高表达（与LPS组比较，P＜0.01）；桂枝汤、参苏饮含药血清均可显著降低Poly（I：C）诱导的MyD88的高表达（与Poly（I：C）组比较，P＜0.05或P＜0.01），结果提示，解表的桂枝汤、参苏饮均可影响MyD88依赖途径。黄连解毒汤和清开灵含药血清均可显著降低LPS诱导的MyD88、TRAF-6 mRNA和蛋白的高表达（与LPS组比较，P＜0.01）。清开灵含药血清还可降低Poly（I：C）诱导的MyD88 mRNA和蛋白的高表达（与Poly（I：C）组比较，P＜0.05或P＜0.01）。四、解表／清热方剂对RAW264.7细胞TRAM、TRIF表达的影响TRAM和TRIF是TLRs下游MyD88非依赖信号转导途径的接头蛋白。研究表明，LPS、Poly（I：C）刺激后，TRAM、TRIF mRNA表达量均有显著增加。桂枝汤、参苏饮含药血清均显著降低LPS诱导的TRAM、TRIF mRNA的高表达（分别与LPS、Poly（I：C）组比较，P＜0.05或P＜0.01）。Poly（I：C）刺激时，桂枝汤、参苏饮只抑制TRAM mRNA的表达，对TRIF mRNA未见明显影响。黄连解毒汤、清开灵含药血清对LPS、Poly（I：C）刺激诱导的TRAM mRNA也表现出明显的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）；两组含药血清对TRIF mRNA表达的抑制作用相对较弱，清开灵含药血清更是未能抑制LPS诱导的TRIF的高表达。结合药物对MyD88、TRAF-6的影响，似乎可以得出，解表剂的作用与MyD88依赖和非依赖的信号转导通路有关，而清热剂的作用则主要通过MyD88非依赖的信号转导通路得以完成。本实验结果提示，解表剂的桂枝汤、参苏饮具有TLR3受体拮抗剂样作用，而清热剂的黄连解毒汤和清开灵具有TLR4受体拮抗样作用。五、桂皮醛、人参皂苷Rg1、小檗碱和黄芩苷对炎症因子的影响本章研究了桂皮醛等4个化学活性单体对RAW264.7细胞的损伤情况。细胞在LPS、Poly（I：C）刺激的同时，加入各浓度梯度的药物，即：桂皮醛：302.66、181.60、108.96、65.07μmol·L-1；人参皂苷Rg1：3.61、2.17、1.33、0.84μmol·L-1；小檗碱：11.89、7.14、4.16、2.68μmol·L-1；黄芩苷：49.36、29.61、17.81、10.73μmol·L-1。作用24 h后MTT法观察细胞存活情况，结果表明桂皮醛等4个单体对细胞活性均无明显影响。在此基础上，分别计算各药物对TNF-α和IFN-β的IC50。LPS、Poly（I：C）刺激下，各药物对TNF-α的IC50分别为：桂皮醛98.67和82.48μmol·L-1；人参皂苷Rg1 0.98和1.05μmol·L-1；小檗碱2.53和2.74μmol·L-1；黄芩苷17.38和4.64μmol·L-1。相对于IFN-β的IC50分别为：桂皮醛74.30和74.91μmol·L-1；人参皂苷Rg10.82和0.87μmol·L-1；小檗碱2.35和2.50μmol·L-1；黄芩苷9.14和16.46μmol·L-1。为此确定各药物实验时的干扰剂量分别为：桂皮醛：75.67μmol·L-1；人参皂苷Rg1：1.08μmol·L-1；小檗碱：2.68μmol·L-1；黄芩苷：17.17μmol·L-1和8.58μmol·L-1。六、桂皮醛、人参皂苷Rg1、小檗碱和黄芩苷对TLR3、TLR4表达的影响与第一部分实验结果相同，LPS特异性地诱导了TLR4的表达，而Poly （I：C）则只诱导了TLR3的特异性表达。桂皮醛、黄芩苷抑制了TLR3、TLR4的表达（p＜0.05或p＜0.01），人参皂苷Rg1对TLR3、TLR4均无明显影响，小檗碱只对TLR4的表达显示了明显的抑制作用。七、桂皮醛、人参皂苷Rg1、小檗碱和黄芩苷对MyD88、TRAF-6表达的影响桂皮醛对LPS、Poly（I：C）诱导的MyD88、TRAF-6高表达均有显著的抑制作用；人参皂苷Rg1、黄芩苷只对Poly（I：C）诱导的MyD88的表达有影响（p值均＜0.05），对LPS诱导的MyD88、TRAF-6表达未见明显作用；与此相反，小檗碱对LPS诱导的MyD88、TRAF-6高表达呈显著抑制作用，但对Poly（I：C）诱导MyD88的高表达无明显影响。八、桂皮醛、人参皂苷Rg1、小檗碱和黄芩苷对RAW264.7细胞TRAM、TRIF表达的影响桂皮醛对TRAM、TRIF的高表达均未见明显的抑制作用；人参皂苷Rg1对TRAM、TRIF mRNA的表达均表现出显著抑制作用（p＜0.05或p＜0.01）；小檗碱对LPS诱导的MyD88、TRAF-6表达无明显影响，但可显著降低Poly（I：C）诱导的TRAM、TRIF mRNA的表达（p＜0.05或p＜0.01）；黄芩苷只对LPS诱导TRAM、TRIF mRNA的高表达有显著抑制作用（p＜0.05或p＜0.01），而对Poly（I：C）诱导的TRAM、TRIFmRNA无明显影响；结合桂皮醛等对MyD88、TRAF-6的影响作用，似乎可以得出以下结论：桂皮醛主要通过抑制TLR3、TLR4及其下游MyD88依赖的信号转导通路相关元件发挥其药效学作用；人参皂苷Rg1不能直接抑制TLR3、TLR4受体的高表达，但对TRAM、TRIF以及Poly（I：C）刺激时的MyD88有显著性抑制作用，提示其可能主要通过调节MyD88非依赖的信号转导通路发挥其药理学作用；小檗碱除直接抑制TLR4受体表达外，也因刺激因素的不同对TLR下游的信号转导通路产生不同的影响，LPS刺激时，小檗碱主要抑制MyD88依赖的信号转导通路，而在Poly（I：C）刺激时，其主要是通过调节MyD88非依赖的信号转导通路达到其药效学作用；黄芩苷对TLR3、TLR4均有抑制作用，但对下游信号转导通路的影响，因刺激因子不同而不同，LPS刺激时，黄芩苷对MyD88依赖和非依赖的信号转导通路均有明显的影响；Poly（I：C）刺激时，黄芩苷则主要影响MyD88依赖的信号转导通路。综上所述，桂皮醛对MyD88依赖的信号转导通路的影响较明显，具有TLR3、TLR4受体拮抗剂样作用；人参皂苷Rg1主要作用于MyD88非依赖途径，对TLR3、TLR4无直接影响；小檗碱对不同刺激因素诱导的TLRs信号转导元件的影响不同，LPS刺激时，小檗碱主要作用于TLR4及其MyD88依赖途径的信号转导，而Poly（I：C）刺激时，则只影响MyD88非依赖途径的信号转导过程，仅显示出一定的TLR4受体拮抗剂样作用；黄芩苷在LPS刺激时主要作用于MyD88非依赖途径，而在Poly（I：C）刺激时，对MyD88依赖途径有影响，具有TLR3、TLR4受体拮抗剂样作用。另外，综合比较中药方剂与其相关活性单体间对TLRs及其下游转导通路信号元件的影响，可以看出方剂与单体之间有一定差异。如桂枝汤含药血清直接抑制TLR3受体的表达，阻断TLR3下游MyD88非依赖信号转导通路上主要信号元件的表达，具有一定的TLR3受体拮抗剂样作用，桂皮醛对TLR3、TLR4均有抑制作用，且影响MyD88依赖的信号转导通路，两者差别较为明显；这似乎表明单体成分的药效学作用不能完全替代中药复方。复方的药效学作用可能较单体的作用为多，也可能较单体的作用为少。出现这一差异可能是中药复方多组分、多成分间整合作用的结果，在这一整合过程中，复方中有效成分的部分作用可能会削弱甚至消失，也可能在整合过程中产生新的药效学作用。