早期乳腺癌患者通常缺乏明显的临床体征，而且目前临床上尚无有效的早期辅助诊断方法，多数病例在确诊时已是中晚期，治疗效果不佳，预后较差。因此寻找乳腺癌的前期发病标志，对于乳腺癌的早期诊治及实施一级预防具有重大意义。近年来，越来越多的研究表明microRNA(miRNA)能够作为癌症的生物学标志。而在血液中检出癌症特异性的miRNA并将其作为癌症的生物学标志对于早期诊断癌症则具有至关重要的意义。目前获得miRNA表达谱的方法有小RNA克隆、Northern印迹、芯片技术、定量实时PCR技术及深测序研究方法，其中测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列，高度同源)，而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。所以本论文采用ABI公司的SOLiD测序仪对乳腺癌病人肿瘤组织和血清miRNA谱进行测序分析，发现差异表达的miRNA，同时发现新的miRNA。本论文分为三部分：　　第一部分　　首先，分别建立肿瘤组织和血清miRNA表达谱：收集未经放疗和化疗的原发性乳腺癌组织及癌旁组织各5例；收集未经放疗和化疗的原发性乳腺癌病人血液13份，年龄匹配健康人血液10份。获得下列miRNA表达谱：(1)乳腺癌组织；(2)癌旁组织；(3)乳腺癌病人血清；(4)对照血清。建立两套不同的miRNA表达谱：乳腺癌组织vs.癌旁组织，乳腺癌血清vs.对照血清，进行比较。我们找出在肿瘤组织和血清均上调表达的miRNA进一步筛选和验证。　　经比对分析，发现7个miRNA(miR-103，miR-23a，miR-29a，miR-222，miR-23b，miR-24andmiR-25)在乳腺肿瘤组织和乳腺癌病人血清中都发生上调改变。　　同时挖掘测序数据，利用生物信息学分析发现一新的miRNA：miR-BS1。　　第二部分　　对候选miRNA进行两轮筛选，首先在小样本中(20份未经放疗和化疗的原发性乳腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织)，检测7个miRNA的表达情况，发现miR-222在乳腺肿瘤组织中上调表达(P<0.05)。然后再在大样本中(未经放疗和化疗的原发性乳腺癌病人(50例)、乳腺良性肿瘤病人(乳腺纤维瘤、乳腺囊性增生病、乳腺大导管乳头状瘤、脂肪瘤，20例)，卵巢癌病人(20例)和正常对照(50例)血清)验证其灵敏度和特异性。结果发现miR-222在乳腺癌病人血清中表达高于健康对照组，P=0.0032，差异有统计学意义。ROC曲线(Rceiveroperativecharacteristic，ROC)分析显示血清miR-222可以区分乳腺肿瘤病人和健康人(曲线下面积为0.6712，95％CI=0.5649to0.7775)。以0.006为截断点(cut-offpoint)(相对于RUN6B的表达)，其灵敏度为74％，特异度为60％。肿瘤样本中miR-222>0.006的OR值(oddsratio)为4.269(95％CI=1.828to9.971)。而且miR-222在乳腺肿瘤病人，健康对照，乳腺良性肿瘤病人和卵巢癌病人血清中表达有明显差异(P=0.006)，提示miR-222可能是潜在的乳腺肿瘤筛选标志物。　　第三部分　　针对前期测序结果利用生物信息学分析发现一新型miRNA，命名为miR-BS1，从二级结构，系统保守性，表达，生物功能，靶基因预测分析等方面综合验证其真实性。1)miR-BS1前体二级结构符合茎环结构，同时是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端。2)在GenBank中搜索不同物种miR-BS1序列发现在小鼠(Musmusculus)，果蝇(Drosophilagrimshawi)，大鼠(Rattusnorvegicus)，非洲爪蛙(Xenopuslaevis)，草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)，棕狒狒(Papioanubis)和大西洋鲑(Salmosalar)中各有一条miR-BS1序列，将不同物种miR-BS1成熟序列进行多序列比对分析，发现为第5位到第11位以及第13位到第17位碱基为保守碱基，说明miR-BS1基因在不同物种间的高度保守性。将miR-BS1“2-8”种子序列与已知发现的hsa-miR比对发现，miR-BS1与miR-3675-3p具有相同的种子序列，同时发现miR-BS1与hsa-miR-20b-3p(ACUGUAGUAUGGGCACUUCCAG)，和hsa-miR-455-3p“8-15”碱基匹配(GCAGUCCAUGGGCAUAUACA)。3)采用NorthernBlot方法证明miR-BS1在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中均有表达，然后Real-TimePCR测定miR-BS1在乳腺肿瘤组织和乳腺肿瘤病人血清中的差异表达，发现miR-BS1在肿瘤组织和肿瘤病人血清中表达均下调。4)采用miR-BS1特异模拟物直接转染至MCF-7和MDA-MB-23l细胞48h后，使用改良的MTT方法测定细胞活性，初步观察到miR-BS1对MCF-7细胞生长有明显抑制作用。我们将进一步确认miR-BS1对细胞增殖作用的细胞生物学机制。5)利用生物信息分析软件，对miR-BS1靶基因进行预测，并对其生物功能进行富集，挑选出与细胞增殖、细胞周期、凋亡等相关的基因，分别是：CUL3，KRAS，ETS1，MNT，CNTN3，CCNK和FOXO3。将这些预测基因包含miR-BS1作用位点的3‘-UTR片段连接进入报告基因，与miR-BS1mimics和negative共转。双荧光报告分析显示，mi-BS1可以显著抑制含KRAS3’-UTR的报告基因活性。