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植物内生真菌种类繁多,资源丰富。近年来对植物内生真菌次生代谢产物的研究,表明植物内生真菌不仅可产生与宿主植物相同或相似一类生物活性物质,而且还能够发现结构新颖、活性多样的新化合物或新天然产物。因而以植物内生真菌途径发掘治疗人类疾病(如肿瘤、病毒、致病微生物等)的一些重要化合物,已成为目前生物学界研究的一个热点领域。本文以有毒植物木本曼陀罗(Daturaarborea L.)为研究对象,研究其内生真菌多样性及其活性代谢产物的状况,以便发掘新种和筛选能防治人类疾病的天然药用成分。
论文首先从木本曼陀罗(Datura arborea L.)植物活体中分离获取内生真菌;其后开展了一系列研究,包括内生真菌的微生物分类鉴定;多样性特征分析;具有生物碱类化合物产生菌株的筛选;具抗菌活性作用的菌株筛选;出发菌株的选择与扩大发酵条件试验;及其代谢产物的基础化学研究,取得以下的研究结果:从木本曼陀罗(Datura arborea L.)根、茎、叶、花组织中分离获得植物内生真菌77株,经形态观察初步鉴定分属2纲、5目、7科、32属,体现出曼陀罗植物内生真菌组成与分布的多样性特点,并且从77株木本曼陀罗植物内生真菌中发现一个新种,定名为曼陀罗丝核菌 Rhizoctonia daturaensis.sp.nov Zheng et Chen,该模式菌株(编号 Ym 312024)已保藏于云南省微生物研究所。
在生物碱类化合物产生菌株的筛选研究方面,从上述木本曼陀罗植物内生真菌资源中,获得2株产生物碱类化合物的内生真菌,为菌株Ym 311977和Ym 312024。在抗菌活性筛选方面,我们观察到对病原细菌、皮肤致病真菌、植物致病真菌具有抑制生长作用的木本曼陀罗植物内生真菌分别有24株、9株、17株,依次占总菌株数的31.2%,11.6%,22.1%:其中7株最大抑菌圈能达到20mm以上,5株内生真菌对10种以上的供试病原微生物有明显的抑制作用,抗菌活性既强且抑菌范围也广的内生真菌有2株,为菌株Ym 312036和Ym 311977。我们对筛选到有价值的菌株进行了系统分类学的研究,根据菌落及显微形态特征,结合18S rRNA基因序列分析,确定编号Ym311977、Ym 312036为已知种类,前者为尖镰孢霉(Fusarium oxysporum),后者是柑橘炭疽刺盘孢菌(Colletotrichum gloeosporioides)。
我们选择菌株Ym 311977(尖镰孢霉 Fusarium oxysporum)为出发菌株,制定出其发酵条件及发酵产物提取工艺,经50立升全自动发酵罐的扩大发酵实验,以及发酵产物的化学提取,从该菌株的发酵产物中分离得到3个单体化合物(311977-A、B、C)各0.210g、2.274g和2.530g,经波谱分析和结构解析,化合物311977-A为5-丁基吡啶甲酸乙酯;311977-B是5-丁基吡啶甲酸;而311977-C化合物则为甘露醇。在特定发酵基质及培养条件下,木本曼陀罗植物内生真菌Ym 311977菌株发酵液的主要代谢产物5-丁基吡啶甲酸(化合物 311977-B)浓度在381.5-453.4 mg.L<-1>范围内。抗菌活性试验的结果,5-丁基吡啶甲酸(化合物311977-B)对17种供试病原微生物具有抑制生长活性作用,最低抑菌浓度(MIC)为50ug.mL<-1>,其抑菌活性的研究结果为本文首次报道。