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脂多糖（LPS）是革兰阴性菌（GNB）细胞壁的主要成份，是GNB脓毒症多种病理生理反应的第一触发因子。其引起的脓毒症和脓毒性休克是严重的危及生命的全身性炎性反应综合症，表现为血压过低、组织灌流不充分和多器官衰竭，其致死率在儿童中达10～15％，在成年人中高达40％左右。除了抗生素和支持疗法外，目前尚无特异有效的治疗药物。 近年来，免疫疗法已成为清除循环血中LPS的重要手段之一。抗LPS单克隆抗体（mAb）自20世纪80年代以来获得了深入研究，针对高度保守的LPS核心糖脂和类脂A的mAbs曾一度被认为可以中和各种GNB的LPSs。但是，许多mAbs，包括令人充满希望的E5和HA-1A mAbs，由于缺乏广泛交叉反应性，均以临床试验失败而告终。本实验室以LPS的体内共同代谢产物LPS-HDL复合物研制出了具有广泛交叉反应性的mAbs，实验证实其对LPS攻击的小鼠有良好的保护作用，目前正在进一步验证其抗LPS效果。 另一方面，新近发现的一种存在于中性粒细胞颗粒中的阳离子蛋白—杀菌/通透性增强蛋白（BPI），具有强大的抗菌和中和LPS功能。重组BPI N端蛋白抗LPS的研究已取得了重大进展，但阻碍其临床应用的缺点也是显而易见的，即与LPS交叉反应性局限、可被LBP竞争抑制及半衰期极短。 为此，本课题在分别完成BPI和抗LPS mAb Fab的CHO表达基础上， 第四军医大学博土学位论文 一 进一步构建和表达了Fab丑PI融合蛋白，以期充分发挥其抗LPS的优越性。 一、＊n 端C＊＊A的克隆与表达 用 RT－PCR方法从正常人外周血多形核粒细胞 tnRNA中扩增出 BPI端 726hp的cDNA，依次克隆人pGEM－T easy和pCDNA3、pGEX－4T＊载体。 序列分析表明，该片段为含有信号肽和中和 LPS活性中心的 BPI端基因片 段。转染CHO细胞，经ELISA、免疫荧光和InRNA鉴定，该片段以可溶性 形式成功地表达于细胞培养上清和细胞浆，免疫印迹试验显示一条约25kD 的蛋白显色区带。同时该片段可以包涵体形式表达于大肠杆菌 DHS Q，证明 了以大肠杆菌表达该抗菌肽的可行性。 二、抗 LPS InAb C3AZ Fab真核表达载体的构建和表达 通过RTPCR方法，获得了广谱抗LP slnAb C3AZ（lgG）的Fd和完整轻链 （LC沁DNA片段。在分别构建了pCDNA3Fd和pCDNA3毛C表达载体的基础 上，将pCDNA3七C质粒中包括hCMV启动子、LC和BGH polyA等序列在 内的片段插人到pcDNA3＊d中hCMV启动子上游，从而构建成单质粒的Fab 表达载体，经500500uyInl 04m筛选转染的CHO细胞，ELISA、兔疫荧光和 fnRNA检测证明，Fab在CHO细胞中获得成功表达，免疫印迹显示一条约 slkD的蛋白区带。 三、FabBPI融合蛋白真核表达载体的构建和表达 将包含 BPI端抗 LPS活性中』O的 180hp DNA片段通过一段长 16个氨 基酸的 Linker连接于上述hb表达载体中刚基因的下游，构建成 Fab－BPI 融合蛋白佣）真核表达载体pCDNA3－FB。序列测定证明连接正确。将其转染 CHO细胞后，经ELISA、免疫荧光、和fnRNA鉴定表达成功，免疫印迹试 验显示一条与抗K轻链和抗BPI抗体反应的60kD左右的蛋白区带。交叉反 应试验证明，细胞表达产物 Fab和 FB与多种 GNB LPS有交叉反应性。电泳 迁移率变化分析（EMS）显示，转染 pcDNA3－BPI巾cDNA3于ab和 pcDNA3－FB 的 RAW264．7细胞在 LPS刺激下，其 NF4 B活化水平均明显低于野生型 RAW264厂细胞，初步证明三种表达产物均有抗LPS活性，其中FB融合蛋白 抗LPS活性相对更强。 4 第四军医大学博士学位论文 广谱抗 LPS InAb Fab、BPI和 FabBPI融合蛋白的真核表达成功，为 GNB 脓毒症的治疗研究奠定了基础；FB作为集广泛交叉反应性和强大中和活性的 僻合蛋n，仆帕6成为更适于临床应用的新的抗LPS免疫制剂。