论文部分内容阅读
Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)作为一种重要的模式识别受体,主要表达于巨噬细胞和树突状细胞表面。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白,属于IL-1R/TLR受体超家族,通过辨认识别生物体内保守的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecule patterns,PAMPs),活化巨噬细胞和树突状细胞,产生细胞因子和趋化因子,启动天然免疫应答,构成机体免疫反应的第一道防线。Toll蛋白最早发现在调控果蝇的胚胎发育过程中起重要作用,目前,在哺乳动物细胞中相继发现并克隆了11种TLR分子,选择性识别病原体中特定的分子结构,以抵抗病原菌的入侵,TLR家族成员的缺失导致机体对病原体高度易感。本课题研究了单核巨噬细胞酪氨酸磷酸酶和热休克对Toll样受体信号转导的调节以及相应的作用机制。 第一部分 SHP-1参与巨噬细胞TLR9信号转导通路的研究 细菌DNA不仅是遗传的物质基础,其中某些特定序列还具有免疫活性。人工合成CpG寡核苷酸(CpG-Oligodeoxynucleotides,CpG ODN)能模拟细菌DNA的免疫活性效应。CpG ODN可活化自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK细胞)、单核/巨噬细胞、树突状细胞、T细胞等,活化后的细胞可分泌IL-1、IL-6、TNFa等细胞因子、趋化因子、NO等免疫效应分子,诱导天然免疫应答。CpG ODN的辨认和信号传导通过TLR9所介导。TLR9识别配体后,通过MyD88-IRAK-TRAF6激酶途径募集接头蛋白髓系分化蛋白88(MyD88),结合并活化IL-1受体相关激酶(IRAKs)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6),活化下游MAPKs和NF-κB诱导激酶(NIK)、IKK、IκBa,活化后的NF-κB入核引起特定基因的表达。 信号转导过程中许多信号分子相互作用,使信号转导保持一定的强度能顺利传导并能及时终止。SHP-1酪氨酸磷酸酶SHP-1(Src homology 2 domain containingphosphatase 1)最早也命名为SHPTP-1,SHP,HCP和PTP1C,是个胞内酪氨酸磷酸酶,主要表达于造血细胞。SHP-1含两个N端SH2区,单个磷酸酶区,以及C端尾部的两个酪氨酸磷酸化区,是个淋巴细胞、巨噬细胞内常见的信号调节分子。本实验浙江大学博士学位论文研究了在CpG ODN活化巨噬细胞TLRg诱导产生细胞因子等细胞免疫反应过程中,SHP一1参与的调节作用及其可能的作用机制。 我们构建了SHP一1高表达载体,PCR定点突变法构建SHP一1催化活性突变载体 (C4535),经测序鉴定正确。合成SHP一1 RNA干扰片段,转染RAW264.7细胞以抑制SHP一1蛋白合成。G418筛选稳定表达SHP一1和催化活性突变mu一SHP一1 RAW细胞,经CpG ODN刺激后,发现稳定高表达SHP一1的巨噬细胞的细胞因子IL6的分泌显著增加,而对于SHP一1催化活性突变的巨噬细胞,经CpG ODN刺激后其IL一6的分泌水平依然升高,与高表达SHP一1巨噬细胞相比没有明显变化。而RNA干扰SHP一1蛋白表达后,IL6的分泌水平下降。荧光素酶报告基因检测显示SHP一1高表达的巨噬细胞经CpG ODN刺激后NF一忍的活化水平增高。这些实验现象表明SHP一1高表达可能促进CpG ODN刺激后NF一沼的活化,从而促进细胞因子IL一6的分泌。而催化活性的高低与SHP一1促进细胞因子的表达关系不大。为进一步探讨SHP一1促进CpG ODN刺激巨噬后IL一6分泌的原因,检测了MApK活化水平的改变。CpG ODN刺激后,发现SHP一1高表达的巨噬细胞ERK、JNK的磷酸化水平没有改变,而p38的磷酸化水平显著增高,说明sHP一1促进IL6的分泌可能部分与p38的磷酸化水平增高有关。免疫共沉淀进一步检测了cpG ODN刺激后与SHP一1在巨噬细胞内相互作用的一些信号分子,发现IKK、TRA王6与SHP一1形成蛋白复合物,显示SHP一1可能通过与IKK、TRAF6结合活化NF一虑,从而促进IL6的分泌。 上述实验结果表明,SHP一1促进CpG ODN刺激巨噬细胞IL6的表达,其催化酶活性的下降对IL6的表达没有明显影响,而RNA干扰后IL6的分泌水平下降,显示SHP一1的表达参与CpG ODN刺激后巨噬细胞p38、NF一虑的活化,而使IL一6的分泌增高,表明SHP一1是个参与CPG ODN江LRg信号通路一个重要的胞内调控分子。本实验结果为深入认识cpG oDN月1,R9介导的信号转导的调控提供了一个新的机制。第二部分热休克调节单核细胞Toll样受体信号转导研究 热休克能通过诱导热休克蛋白(Heat shock protein:3,HSPs)等应激蛋白诱导机体的固有免疫应答。免疫反应中抗原递呈细胞(Antigen一Presenting een,APC)通过调节病原识别受体(pathogen reeo邵ition reeeptors,pRRs),识别病原相关的分子模式(RAMPs)