目的:在全世界范围内,肺癌是发病率最高并且死亡人数最多的恶性肿瘤之一。根据最新的统计数据显示,肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤,而且发病率仍在逐年上升。所以我国现今对于肺癌的预防、早诊早治工作仍需进一步加强和改善,对于肺癌的防治工作仍是抗癌工作的重中之重。早期肺癌的症状通常较为隐匿,目前缺乏行之有效的早诊手段,所以对于肺癌的早诊早治工作的开展难度很大,多数肺癌患者在确诊时已经处于中晚期,而原发性肺癌患者的五年生存率仅为15%。大约70%的患者确诊时已处在局部晚期或已经发生转移的恶性程度,失去了最佳手术治疗的机会。并且由于肺癌的异质性和易出现化疗药物耐药性,近些年肺癌患者的预后状况并没有明显的改善。20世纪70年代时,肺癌在我国恶性肿瘤死亡率中排在第5位,与同期的其他国家相比,仍处于一个相对较低的水平,但经过其后几十年的发病率上升后,肺癌已经成为我国癌症死亡人数最多的恶性肿瘤。肺癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果,尽管吸烟被公认为引起肺癌发生的最重要的环境危险因素,但统计数据显示,仍然有15%的男性肺癌患者和53%的女性肺癌患者的发病并不是由吸烟直接造成的。越来越多的证据表明,遗传因素在肺癌的发生发展过程中发挥着不可替代的重要作用,但在肺癌发生过程中的确切分子机制尚未完全阐明,因此对于遗传因素在肺癌中所发挥作用的确切机制有必要进行更深入的探索。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一组长度大于200碱基长度的,不能编码蛋白的RNA,具有组织表达特异性和时空表达特异性。据估计,非编码RNA约占人类基因组的70%以上。有功能研究证据表明,lncRNA在多种肿瘤发生过程中发挥基因表达调控的重要作用,lncRNA可能影响肿瘤细胞的细胞增殖,细胞侵袭、转移能力,细胞周期和细胞凋亡等过程和能力。微小RNA(microRNA)是一组进化保守的,长度为21-24碱基的不能编码蛋白的短链微小RNA。microRNA可以与编码基因的信使RNA的3’非翻译区完全或者不完全互补配对,可能导致该信使RNA被降解或其翻译过程受到抑制,从而调控信使RNA翻译的活动。有研究表明,microRNA可以参与细胞的多种生理、病理过程如细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡和炎症反应过程,这些过程的失调经常与肿瘤发生有关。有大量证据表明,microRNA可以发挥原癌基因或者抑癌基因的作用,并且许多种microRNA基因位于肿瘤相关的基因所在区域,microRNA的异常表达现象存在于多种恶性肿瘤组织,因此,研究microRNAs与恶性肿瘤发生的关系对于开发恶性肿瘤的诊断标志物和靶向治疗具有重要价值。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是存在于基因组中最常见的一类变异,是DNA序列上单个的碱基替换,人类基因组中总共大约30亿个碱基,平均每1000个碱基中就可能存在一个SNP。已有研究证据表明lncRNA和microRNA上的SNP与多种恶性肿瘤的易感性和预后有关。竞争性内源RNA机制是近些年提出的一个假说,主要的核心观点是:在细胞中信使RNA、长链非编码RNA、假基因(pseudogene)或其他分子拥有共同的microRNA反应元件(microRNA response element,MRE),是这些分子上的一段共同的特定microRNA互补结合序列,这就可能造成这些分子竞争与microRNA结合,从而影响microRNA调控下游基因过程。有研究报道长链非编码RNA HOTAIR在肺癌中发挥原癌基因的作用,可以促进肺癌的发生发展,但HOTAIR上的SNP位点多态性与肺癌的关系仍不明确。有证据表明,miR-149在肺癌中发挥抑癌基因的作用,但miR-149上的SNP位点多态性与肺癌易感性的联系未有定论。因此本研究探索长链非编码HOTAIR和miR-149基因多态性与肺癌易感性的关系,并验证HOTAIR,miR-149-5p和HNRNPA1在肺癌发生过程中的竞争性内源RNA机制。研究方法:第一部分,我们采用以医院为基础的病例对照研究,探索了长链非编码RNA HOTAIR上的3个SNP位点,rs920778,rs12826786和rs4759314与肺癌易感性之间的关系。研究对象包括551名肺癌病例和543名来自体检中心的健康对照,所有纳入的研究对象全部都是汉族。病例来自中国医科大学附属第四医院、中国人民解放军北部战区总医院和中国医科大学附属第一医院三家三级甲等医院,并且在捐献5ml静脉血前未经过放射治疗和化学治疗。对照均选自同一时期在上述医院体检中心体检的健康人。所有参与研究的对象,均在签署知情同意书后,捐献5ml静脉血。我们采用酚-氯仿法对所有血样提取基因组DNA,使用ABI公司的Taqman探针引物对研究对象的基因组DNA进行SNP分型。两组间连续变量和分类变量的比较分别采用t检验和卡方检验。采用Logistic回归模型计算OR及其95%置信区间来估计不同SNP位点的不同基因型与肺癌发病风险之间的关系。本研究经过中国医科大学伦理委员会审批通过。第二部分的研究探索了miR-149上的一个SNP位点rs2292832与肺癌易感性的关系。研究是采用以医院为基础的病例对照研究。本研究最终纳入555名病例和395名健康对照。病例来自中国医科大学附属第四医院、中国人民解放军北部战区总医院和中国医科大学附属第一医院三家三级甲等医院,对照均来自同一时期在医院体检中心体检的健康人。所有研究对象在签署知情同意书后捐献5ml静脉血。我们从静脉血中提取了全基因组DNA,使用ABI公司的Taqman探针引物对研究对象的基因组DNA进行SNP分型。两组间连续变量和分类变量的比较分别采用t检验和卡方检验。采用Logistic回归计算OR及其95%可信区间来评价不同基因型与肺癌发病风险之间的关系。本研究经过中国医科大学伦理委员会审批通过。第三部分的研究通过构建HOTAIR的小干扰RNA(siRNA),过表达HOTAIR和miR-149-5p慢病毒转染入肺癌细胞系A549和SPC-A-1来探讨其对癌细胞的增殖、转移,细胞周期和凋亡等细胞生物学行为的影响。我们运用划痕修复实验和Transwell实验来检测HOTAIR和miR-149-5p对肺癌细胞迁移和侵袭能力的影响。使用Celigo全视野细胞分析仪检测4个时间点肺癌细胞的融合度,分析HOTAIR和miR-149-5p对细胞增殖的影响。使用流式细胞技术来检测肺癌细胞的细胞周期和凋亡情况,探究HOTAIR和miR-149-5p对细胞周期和凋亡的影响。使用双荧光素酶报告基因验证HOTAIR与miR-149-5p的靶向结合关系以及miR-149-5p与HNRNPA1的靶向结合关系。结果:第一部分病例对照研究结果显示:HOTAIR rs12826786、HOTAIR rs4759314与肺癌的发病风险存在有统计学意义的关联,HOTAIR rs920778与肺癌的易感性的关联无统计学意义的关联。分层分析显示HOTAIR rs4759314与肺腺癌、肺鳞状细胞癌、小细胞肺癌的发病风险有统计学意义的关联。HOTAIR rs12826786与小细胞肺癌的关联有统计学意义。第二部分的病例对照研究结果显示:miR-149 rs2292832与肺癌易感性没有统计学意义上的关联。分层分析结果显示miR-149 rs2292832与非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌的易感性也没有统计学意义上的关联。我们还分析了miR-149 rs2292832多态性与烹饪油烟暴露在肺癌发生中是否存在基因-环境交互作用,结果没有统计学意义。第三部分HOTAIR与miR-149-5p的功能学研究结果显示:HOTAIR在SPC-A-1中本底表达量比肺正常支气管上皮细胞HBE更高,A549本底HOTAIR表达量比HBE低。miR-149-5p在SPC-A-1的本底表达量比HBE低。我们就在A549细胞系中过表达HOTAIR,在SPC-A-1细胞系中敲除HOTAIR和过表达miR-149-5p,进行接下来的一系列功能实验。划痕修复实验结果表明,HOTAIR可以促进肺癌细胞转移,miR-149-5p可以抑制肺癌细胞的转移。Transwell实验结果证明HOTAIR可以促进肺癌细胞的侵袭,miR-149-5p可以抑制肺癌细胞的侵袭。流式细胞仪检测周期的结果表明,HOTAIR过表达可以使G0/G1期的细胞变少,S期细胞增多,从而促进细胞增殖。miR-149-5p过表达可以使G0/G1期细胞百分比增多,引起G0/G1期阻滞,S期的细胞百分比减少,从而抑制细胞增殖。HOTAIR敲除可以使G0/G1期细胞增多,引起G0/G1期阻滞,S期细胞百分比减少,从而抑制细胞增殖。细胞凋亡实验的结果显示HOTAIR和miR-149-5p对凋亡的影响结果没有统计学意义。双荧光素酶活性检测结果和Western Blot的结果显示miR-149-5p与HNRNPA1和miR-149-5p与HOTAIR是靶向结合的关系,HOTAIR-miR-149-5p-HNRNPA1 ceRNA机制是成立的。结论:1.HOTAIR rs4759314、HOTAIR rs12826786与肺癌易感性有关。分层分析显示HOTAIR rs4759314与肺腺癌、肺鳞癌、肺小细胞癌易感性有关,HOTAIR rs12826786与小细胞肺癌易感性有关。2.miR-149 rs2292832与肺癌易感性无统计学意义上的关联。3.miR-149-5p可抑制肺癌细胞的迁移、侵袭、增殖,HOTAIR可促进肺癌细胞的迁移、侵袭、增殖,HOTAIR-miR-149-5p-HNRNPA1形成的竞争性内源RNA机制成立。