论文部分内容阅读
光学纯扁桃酸是合成许多高附加值医药、农药和精细化学品的重要中间体,目前利用生物催化法制备光学纯扁桃酸的研究热点之一就是利用腈水解酶催化消旋扁桃腈的立体选择性水解。羟腈裂解酶作为少数几种能够催化对映选择性碳碳键生成反应的酶之一,它除了能够催化氢氰酸与醛/酮的对映选择性加成生成手性羟基腈外,还可催化硝基烷烃化合物与醛/酮的加成反应生成有机合成的重要中间体硝基醇化合物,因而也越来越受到人们的关注。本文对产碱杆菌的腈水解酶进行了克隆表达和纯化,并研究了重组腈水解酶的理化性质；对重组大肠杆菌细胞催化扁桃腈去消旋化反应制备光学纯扁桃酸的过程进行了详细的研究；通过理性改造显著提高了植物酯酶衍生的羟腈裂解酶的活力,并研究了其分子进化途径：构建了酯酶和羟腈裂解酶的四个祖先酶,并探索了利用祖先酶催化新颖非天然反应的可能性。论文的主要工作包括以下四部分内容：第一,产碱杆菌腈水解酶的克隆表达及纯化表征。将产碱杆菌腈水解酶在大肠杆菌中进行过量表达后,其表达水平达到了野生型菌株的160倍以上。确定重组腈水解酶的最适底物是苯乙腈,最适反应温度和pH值分别为40-45℃和8.0。与其他文献报道的腈水解酶相比,该重组腈水解酶表现出更好的热稳定性和pH稳定性。动力学研究表明,该重组腈水解酶的最大反应速率和米氏常数分别为27.9μmol min-1mg-1和21.8mM。第二,重组腈水解酶催化扁桃腈水解制备光学纯扁桃酸的研究。当以重组大肠杆菌整细胞作为催化剂时,底物耐受性由野生型菌株的20mM提高到了200mM,同时重组大肠杆菌整细胞具有较好的操作稳定性,重复利用10批次后仍有40%的残余活力。研究表明,扁桃腈、苯甲醛和酸性环境会显著抑制腈水解酶的活力,为了缓解底物的抑制作用,采用了水-甲苯两相反应体系,使得重组腈水解酶的底物耐受性由单水相时的200mM进一步提高到了500mM。通过分批补加底物的策略,可使反应液中产物的累积浓度高达93g/L。同时,为了提高催化剂在两相体系中的稳定性和方便产物与催化剂的分离,利用海藻酸钙对重组大肠杆菌细胞进行包埋固定化,成功实现了光学纯扁桃酸在2L规模的扩大制备。以海藻酸钙凝胶包埋的重组大肠杆菌细胞作为催化剂,重复利用5批次后,总共获得110.7g(R)-(-)-扁桃酸,产物的ee值为98.0%,催化剂的产率为13.8g扁桃酸/g细胞。第三,羟腈裂解酶的理性改造。通过理性改造的手段仅仅需要三个氨基酸的突变(H80E/F151L/F155L)便成功地将植物酯酶衍生的羟腈裂解酶(G12T/M239K)的活力提高了300倍左右,改造后羟腈裂解酶的催化效率甚至要高于天然的羟腈裂解酶(12900min-1vs.110min-1and1300min-1)。更重要的是,所有突变体均具有硝基醛缩酶活力,其中最好的一个突变体(G12T/H80E/F151L/F155L/M239K)的比活力和催化常数分别达到了80U/mg和30000min-1。最后,提出了由植物酯酶(SABP2)到羟腈裂解酶(SABP2G12T/H80E/M239K)的分子进化途径。第四,祖先酶的构建和分子改造。构建了酯酶和羟腈裂解酶的四个祖先酶,研究发现所有四个祖先酶均具有羟腈裂解酶活力,HNL2的活力最高达到8U/mg；其中两个祖先酶(HNL6&HNL8)还表现出较高的酯酶活力,分别为0.46U/mg和0.23U/mg,而另外两个祖先酶(HNL2&HNL4)则没有任何酯酶活力。有趣的是,所有祖先酶都具有硝基醛缩酶活力,特别是HNL2,其活力达到接近2U/mg,几乎是天然羟腈裂解酶活力的200倍。最后,通过理性设计的方法,我们不仅成功地往HNL4中引入了酯酶活力,同时还保留了大部分的羟腈裂解酶活力。