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目的:研究在糖尿病小鼠的下肢缺血模型中,抗血管内皮生长因子对缺血下肢血流的影响及其作用机制。方法:1.糖尿病小鼠的喂养:给予普通C57/BL6小鼠高脂高糖饲料,喂养14周,测定其血糖值。2.下肢缺血模型的建立:将小鼠麻醉后,结扎其左下肢股动脉,并且在双结之间离断股动脉干支,复温后,应用激光多普勒扫描仪对小鼠双下肢血流进行扫描,记录其血流灌注恢复情况。在结扎前和结扎后(1d)、3d、7d、11d、14d对小鼠双下肢进行扫描并记录其血流恢复情况。将实验小鼠分为四组,糖尿病小鼠对照组、糖尿病小鼠贝伐单抗(血管内皮生长因子抑制剂)组、普通C57/BL6小鼠对照组和普通C57/BL6小鼠贝伐单抗组。各组均为18只小鼠,小鼠经腹腔注射贝伐单抗或生理盐水,在结扎后(1d),3d,7d,11d各给予等量的贝伐单抗或生理盐水一次,在第13天时,尾静脉注射检测血管渗漏的荧光染料,利用小动物活体成像仪监测小鼠的血管渗漏情况。在第3、7、14d时,各组分别处死6只实验小鼠,取小鼠下肢双侧腓肠肌。3.蛋白质印迹法检测待测组织样品中血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growth factor-A;VEGF-A)的含量:取实验小鼠腓肠肌,液氮研磨肌肉组织并加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂制备成蛋白原液,然后根据蛋白质印迹法的步骤进行实验操作,检测肌肉组织中V EGF蛋白的表达量。4.应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay;elisa)法对待测组织样品中vegf-a、血小板源性生长因子-bb(plateletderivedgrowthfactor-bb;pdgf-bb)的含量进行检测:按照mouse-pdgf-bb、mouse-vegf-aelisa试剂盒操作方法对小鼠腓肠肌样品进行检测,检测其vegf-a、pdgf-bb的含量。5.rt-pcr分析待测组织中pdgf-bb的表达:按照提取总rna的实验方法对组织进行研磨、裂解及提取,然后将提取得到的总rna逆转录为cdna。最后利用rt-pcr仪分析其目的基因pdgf-bb的表达水平。6.免疫荧光法分析小鼠下肢双侧腓肠肌血管新生及成熟情况:取小鼠下肢腓肠肌,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制成病理切片,用anti-pecam-1、anti-ng-2标记血管内皮细胞、血管平滑肌细胞及周细胞,对荧光标记进行统计分析,计算血管新生及周细胞覆盖程度。7.体外细胞实验检测贝伐单抗诱导细胞分泌pdgf-bb的水平:将人脐静脉血管内皮肌细胞(humanumbilicalveinendotheliumcell;huvec)分别培养于四个培养皿中,分为4个小组,分别为空白组、贝伐单抗组、vegf组、贝伐单抗+vegf组,在无血清培养基情况下,向各组中加入对应刺激因子,培养24小时后,收集细胞做elisa实验。8.统计方法:采用spss17.0软件进行单因素方差分析,p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.贝伐单抗对小鼠缺血下肢血流恢复的影响:各组小鼠腓肠肌处血流恢复有较大差异,其中,给予贝伐单抗的糖尿病小鼠组血流恢复情况优于给予生理盐水的糖尿病小鼠组。2.蛋白质印迹实验,给予贝伐单抗的糖尿病小鼠组的vegf蛋白量低于糖尿病小鼠对照组的vegf蛋白量。3.待测样品eLISA结果显示,糖尿病小鼠对照组缺血侧腓肠肌中VEGF-A的蛋白水平明显高于同时间点的糖尿病小鼠贝伐单抗组VEGF-A的蛋白水平。在第7天时,糖尿病小鼠对照组的VEGF蛋白水平最高。随着时间的推移,贝伐单抗组的PDGF-BB蛋白含量逐渐升高,并且在第7、14天时,糖尿病小鼠贝伐单抗组的PDGF-BB蛋白水平均高于同时间点糖尿病小鼠对照组的PDGF-BB蛋白水平。4.体外细胞实验结果显示:与其他组相比,贝伐单抗刺激人脐静脉内皮细胞分泌的PDGF-B B无明显差异。5.RT-PCR结果显示,糖尿病贝伐单抗组小鼠缺血侧中PDGF-BB的表达量高于糖尿病对照组小鼠缺血侧PDGF-BB的表达量。6.小动物活体成像结果显示:在第14天时,糖尿病小鼠贝伐单抗组的血管渗漏程度明显低于糖尿病小鼠对照组。7.免疫荧光结果显示:第7、14天时,各组缺血侧的微血管密度均大于第3天时缺血侧的微血管密度。在第14天时,各组的微血管密度基本一致,但与其他组相比,糖尿病小鼠贝伐单抗组周细胞覆盖程度最高。结论:1.贝伐单抗可以促进糖尿病小鼠缺血下肢血流灌注的恢复。2.贝伐单抗可上调PDGF-BB基因水平的表达。3.贝伐单抗减少血管渗漏、促进血管成熟。4.贝伐单抗增加周细胞覆盖,促进新生血管成熟。