背景与目的人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)可引起一系列上皮病变,有些型别HPV与癌前病变相关,称为高危型HPV,部分人感染高危型HPV后可发生癌变。国际癌症研究机构在1995年认定HPV-16, HPV-18两种型别在人类有致癌作用。宫颈癌与高危型HPV感染的相关性已得到普遍认可。流行病学、分子和临床证据表明,高危型HPV感染除了与宫颈癌有强烈相关性之外,还与部分头颈部鳞状细胞癌(Head and neck Squamous cell carcinoma, HNSCC)的发生密切相关。在HPV相关的HNSCC中,目前研究最多的是口咽部鳞状细胞癌(Oropharyngeal squamous cell carcinoma, OSCC)。临床证据表明,HPV相关OSCC通常不具备此类疾病中典型的大量抽烟和／或饮酒病史,在生物学行为上不同于经典的OSCC, HPV感染与否对OSCC病人的预后有显着影响,无论是治疗效果还是生存率,HPV阳性OSCC病人都优于HPV阴性OSCC病人。喉鳞癌和喉咽鳞癌是HNSCC中两种常见恶性肿瘤,多发于中老年男性,大量抽烟和／或饮酒是其公认的致癌因素,然而有一部分患者并无大量抽烟和／或饮酒的病史,针对这部分患者的发病原因,研究者将目光转向了HPV感染。许多研究机构对喉鳞癌和喉咽鳞癌组织中HPV感染情况进行了检测,以往的研究多为回顾性研究,检测的癌组织来自病理存档标本,病人临床资料的获得受到诸多限制。此外,喉部与喉咽部解剖位置毗邻,部分晚期癌肿仅凭病理标本不易鉴别原发位置,鉴于喉鳞癌发病率显着高于喉咽鳞癌,大多数研究者便将喉咽鳞癌归入喉鳞癌一并研究。因此,报道喉鳞癌HPV感染率的文献很多,但鲜有喉咽鳞癌HPV感染情况的报道,HPV在喉咽鳞癌中的感染率及常见感染型别均不明确。喉咽鳞癌和喉鳞癌的临床表现有一定的相似性,但却是原发于不同解剖部位的两种HNSCC,二者的分化程度、局部淋巴结转移率及5年生存率有明显不同,喉咽鳞癌的预后更差。而且目前研究认为HPV感染主要与HNSCC的预后相关,因此在开展HPV感染相关性研究时,有必要将喉咽鳞癌与喉鳞癌进行区分,将喉咽鳞癌作为独立的疾病进行相关研究。本课题拟对收集的28例喉咽鳞癌新鲜冰冻组织标本进行HPV DNA检测并分型,了解人喉咽鳞癌组织中HPV感染情况及常见HPV型别。E6、E7基因为HPV基因组早期区基因,编码E6、E7蛋白,HPV-16编码的E6、E7蛋白是其发挥致癌作用的主要癌蛋白。慢病毒载体(Lentivirus vector)可以高效率且稳定的感染各期细胞,是将基因整合入细胞的良好运载工具,且具有操作简便、感染效率高、作用稳定、安全性好等优点。本课题拟利用重组HPV-16E6-E7基因的慢病毒感染人喉咽鳞癌FaDu细胞,观察HPV-16E6-E7基因整合对FaDu细胞生物学行为的影响。微小RNA (miRNA或microRNA)参与了人体细胞的分化、增殖、凋亡、侵袭、及迁移等几乎所有的细胞生物学过程。miRNAs的异常表达与许多肿瘤的发生、发展相关,可发挥癌基因或抑癌基因的作用。然而目前对HPV相关HNSCC的]miRNAs表达情况了解有限。本课题拟对仅感染HPV-16和HPV阴性的喉口咽鳞癌组织miRNAs表达水平进行检测,同时检测人喉咽鳞癌FaDu细胞整合HPV-16E6-E7前后miRNAs表达水平的变化,分析HPV-16感染对人喉咽鳞癌组织和细胞株miRNAs表达的调控。第一部分人喉咽鳞癌新鲜冰冻组织中HPV检测及分型方法1.收集28例人喉咽鳞癌新鲜组织标本,液氮速冻后移入-80℃低温冰箱保存。2.应用基因组DNA小量试剂盒提取新鲜冰冻喉咽鳞癌组织标本基因组DNA。3.PCR-反向点杂交法检测标本中HPV DNA并分型4.将HPV感染情况与病人临床资料相结合,进行相关性分析。结果1.28例喉咽鳞癌标本HPV感染情况如下：HPV阳性者7例,总阳性率为25.0%(7/28)。5例为单一型别HPV感染,HPV-16型3例,HPV-18型1例,HPV-52型1例；2例为两种型别HPV同时感染,HPV-16,33型1例,HPV-16,52型1例。2.HPV阳性与HPV阴性病人相比较,大量抽烟和／或饮酒病史有显着性差异(P<0.05)；年龄、性别、病理分型和肿瘤T分期之间的差异无统计学意义(P>0.05)第二部分HPV-16E6-E7基因整合对FaDu细胞生物学行为的影响方法1.重组HPV-16E6-E7慢病毒的制备：全基因合成HPV-16E6-E7基因,并在两端分别加上HindⅢ和KpnⅠ限制性核酸内切酶位点,与慢病毒载体pLV-EGFP-C在T4连接酶的作用下连接,将连接体系转化入DH5a感受态细菌,挑选长出的菌落进行测序鉴定,即得到重组HPV-16E6-E7慢病毒。2.重组HPV-16E6-E7慢病毒的包装：>制备用于包装的质粒DNA溶液：将慢病毒包装载体pH1、pH2与重组HPV-16E6-E7’慢病毒质粒按照一定比率混合于50mL无血清DMEM培养基中。》制备转染试剂稀释液：取一定体积的转染液Polyfect-V与500μL无血清DMEM培养基混合。>将转染试剂稀释液加入用于包装的质粒DNA溶液中,立刻充分混匀,即制备成为转染混合液。室温孵育转染混合液15min,消化HEK293T细胞,每lml转染混合液加入10ml细胞悬液,轻轻吹吸细胞混匀。将细胞悬液加入10cm培养皿,放入37℃培养24h。去除含有转染试剂的培养基,用10ml病毒培养基换液。转染后48h培养上清即含病毒颗粒,收集并测定病毒滴度,.80-C保存。3.重组HPV-16E6-E7漫病毒感染人喉咽鳞癌FaDu细胞：复苏FaDu细胞,用含有重组HPV-16E6-E7慢病毒颗粒的慢病毒液感染FaDu细胞。48h后观察荧光表达情况,用含有0.5μg/mL puromycin的DMEM高糖培养基进行筛选培养,3周后得到稳定转染细胞。PCR检测FaDu细胞中HPV-16E6、E7DNA, RT-PCR检测FaDu细胞中HPV-16E6、E7mRNA, Western-blot检测细胞中E6、E7蛋白。4.将细胞分为3组：实验组(重组HPV-16E6-E7慢病毒稳定感染的FaDu细胞)、载体对照组(慢病毒空载体稳定感染的FaDu细胞)和空白对照组(未感染慢病毒的FaDu细胞)。5. CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖情况,分别测定实验组、载体对照组和空白对照组细胞孔内的吸光度值(A),绘制各组细胞的生长曲线。6.收集各组细胞,通过PI染色用流式细胞仪检测细胞周期的变化；通过PI和Annexin-V联合染色检测细胞的凋亡。7.分别收集实验组、载体对照组和空白对照组细胞,酶联免疫吸附法检测细胞Caspase-3、Caspase-9活性。8. Transwell侵袭实验,检测各组细胞的体外侵袭能力变化。将Matrigel胶均匀铺于聚碳酸酯膜内表面,在上室分别加入三组细胞悬液各l00μL,在下室中加.A.500-L含趋化因子的DMEM完全培养基,37℃培养箱孵育48h,计算侵袭细胞数。结果1.重组HPV-16E6-E7慢病毒测序结果与设计序列进行同源性比较分析,结果显示目的DNA E6-E7序列与设计序列完全一致；2.慢病毒滴度测定结果：重组HPV-16E6-E7漫病毒滴度为1.15×108MOI,空载体慢病毒滴度为2.09×108MOI。3.重组HPV-16E6-E7慢病毒感染人喉咽鳞癌FaDu细胞及筛选结果显示：重组HPV-16E6-E7’慢病毒和空载体慢病毒感染FaDu细胞48h后用荧光显微镜观查,在感染上述慢病毒的细胞中可见明亮的绿色荧光蛋白EGFP表达。说明得到稳定感染重组HPV-16E6-E7’慢病毒和空载体慢病毒的FaDu细胞。4.收集重组HPV-16E6-E7慢病毒感染后的FaDu细胞,提取细胞基因组DNA,用E6和E7基因上下游引物分别进行PCR扩增鉴定。1.5%琼脂糖凝胶电泳可见,在接近500bp处有一明亮条带,与HPV-16E6基因序列的理论值474bp一致；在接近250bp处也有一明亮条带,与HPV-16E7序列的理论值297bp一致。5. RT-PCR结果显示：重组HPV-16E6-E7’慢病毒稳定感染的FaDu细胞中HPV-16E6、E7mRNA相对表达量分别为(2.6±0.22和1.8±0.12),明显高于空载体组(0.003±0.0001和0.003±0.0002)和未转染组(0.002±0.0002和0.005±0.0001),有显着性差异(P<0.05)。6.免疫印迹结果显示重组HPV-16E6-E7曼病毒稳定感染的FaDu细胞有明显的E6. E7蛋白印迹条带。与RT-PCR检测mRNA结果一致,说明制备的重组HPV-16E6-E7’慢病毒感染FaDu细胞后能够高效表达E6、E7蛋白。7. CCK-8细胞增殖检测试剂盒分别测定各组细胞孔内的吸光度值(A),实验组在第2d、3d、4d、5d的吸光度值分别为0.6418±0.0391、1.0808±0.0878、1.3598±0.0464、1.5936±0.1107与载体对照组(0.5442±0.01490、0.8952±0.0358、1.2002±0.0549、1.3848±0.0388)和空白对照组(0.5268±0.0320、0.888±0.03302、1.2162±0.0320、1.4228±0.0444)比较,吸光度值(A)明显升高,有显着性差异(p<0.05)。8.流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡结果显示：实验组(7.246±0.815)与载体对照组(13.464±0.609)和空白对照组(13.298±1.324)比较,细胞凋亡率显着降低,均有显着性差异(p＜0.01)；空白对照组与载体对照组比较,平均细胞凋亡率无显着性差异(p＞0.05)。说明HPV-16E6-E7整合可抑制FaDu细胞的凋亡。9.酶联免疫吸附法检测细胞Caspase-3、Caspase-9活性结果显示：实验组、载体对照组和空白对照组Caspase-3相对活性分别为1.398±0.106、2.538±0.24和2.587±0.19; Caspase-9相对活性分别为1.268±0.083、1.992±0.13和1.984±0.11。实验组与2个对照组(空白对照组和载体对照组)细胞相比较,Caspase-3、Caspase-9相对活性均显着降低,均有显着性差异(p<0.01)。10.流式细胞术分析细胞周期结果显示：实验组GO-G1期、S期和G2-M期各期所占比率分别为53.816±1.665、28.836±1.013和17.348±0.878；载体对照组分别为62.284±1.609、22.292±0.970和15.424±1.236；空白对照组分别为62.262±2.139、22.664±1.551和15.074±1.451。空白对照组与载体对照组细胞S期、G2/M期和G0/G1细胞比例比较,差异无显着性(p>0.05)实验组与2个对照组(空白对照组和载体对照组)比较,S期和G2/M期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少,有显着性差异(p＜0.05)。说明FaDu细胞基因组整合HPV-16E6-E7后,S期和G2/M期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少,促进细胞分裂增殖。11.细胞Transwell实验结果显示：实验组体外侵袭实验视野内平均细胞数为117.4±14.8,载体对照组和空白对照组分别为68.4±8.2和72±8.1,实验组与2个对照组(载体对照组和空白对照组)比较,穿透Matrigel的平均细胞数显着增加,有显着性差异(p＜0.01)。说明FaDu细胞基因组整合HPV-16E6-E7后,FaDu细胞穿透Matrigel的能力显着增强,细胞侵袭转移能力增强。第三部分HPV-16感染对喉咽鳞癌组织及FaDu细胞miRNA表达的调控方法1.稳定培养实验组、载体对照组和空白对照组FaDu细胞,确认3例仅HPV-16感染及21例HPV阴性的新鲜冰冻喉咽鳞癌组织。2.提取人喉咽鳞癌组织及各组细胞总RNA。3. qRT-PCR检测各组标本及细胞总RNA中miR-363、miR-15a和miR-155的表达水平。结果1.仅感染HPV-16的喉咽鳞癌组织标本中IniR-363、miR-15a和miR-155的表达水平分别为5.62±3.48、1.97±0.48和0.34±0.08；HPV阴性的喉咽鳞癌组织标本中各miRNA表达水平分别为0.90±1.53、1.09±1.31和1.92±1.47；实验组细胞中各,miRNA表达水平分别为6.75±0.17、4.15±0.13和0.16±0.01；载体对照组细胞中各miRNA表达水平分别为0.09±0.01、0.20±0.01和7.01±1.04；空白对照组细胞中各miRNA表达水平分别为0.09±±.0.003、0.21±0.003和4.14±0.02。2.与HPV-16阴性的人喉咽鳞癌组织相比,HPV-16阳性人喉咽鳞癌组织中miR-363、miR-15a表达显着上调,miR-155表达无显着变化；与未转染HPV-16E6-E7基因的FaDu细胞相比,转染HPV-16E6-E7基因的FaDu细胞中miR-363、miR-15a表达显着上调,miR-155表达无显着变化；HPV-16阳性的人喉咽鳞癌组织与整合HPV-16E6-E7的FaDu细胞中miR-363、miR-15a和miR-155表达水平无显着性差异；HPV-16阴性的人喉咽鳞癌组织与未整合HPV-16E6-E7的FaDu细胞中niR-363、miR-15a和miR-155表达水平亦无显着性差异。结论1.喉咽鳞癌组织中存在HPV感染,本组标本中HPV阳性率为25.0%(7/28),HPV-16是最常见的感染型别；2.在本课题包含的28例喉咽鳞癌病人中,与HPV阴性病人相比,HPV阳性病人中具有大量抽烟和/或饮酒病史者较少,差异有显着性；3.人喉咽鳞癌FaDu细胞基因组整合HPV-16E6-E7后,细胞的增殖能力和侵袭力增强,细胞凋亡受到抑制,S期和G2/M期细胞比例增加,G0/G1期细胞比例减少。4.在HPV-16阳性喉咽鳞癌组织和转染HPV-16E6-E7基因的FaDu细胞中,miR-363、miR-15a表达显着上调,miR-155表达无明显变化。