中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子( Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor, MANF),是一种分泌蛋白,约20KD,最初从体外培养的大鼠中脑Ⅰ型星形胶质细胞株中分离出来。它和保守型多巴胺能神经营养因子(Conserved Dopamine Neurotrophic Factor, CDNF)同属于新生的神经营养因子保守家族。最近研究发现,体内或体外培养的神经元受到损伤刺激时MANF的表达会升高。然而MANF在不同类型胶质细胞,尤其是星形胶质细胞中的表达模式尚未明了。为了深入研究这个问题,检测了正常大鼠和脑缺血大鼠神经元MANF的表达量。令人惊讶的是,发现正常大鼠的大脑皮层中,MANF主要由神经元分泌,星形胶质细胞仅在严重缺血时表达MANF,这与它的名称不符合。然而,在体外培养的原代神经胶质细胞,包括星形胶质细胞中可见MANF表达,使用ER应激的刺激或营养被剥夺可使MANF表达上调。另外,最有趣的是小胶质细胞MANF的表达模式,皮层和海马散在的活化的小胶质细胞可表达MANF,但轻度缺血导致的小胶质细胞聚集时MANF无明显表达。这些结果表明,MANF的表达是可诱导的,且在不同类型的胶质细胞中的表达具有差异性,脑组织中神经元是MANF的主要来源。　　目的:　　观察MANF在中枢神经胶质细胞中的表达情况。　　方法:　　线栓法制作SD大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,分别缺血2小时和4小时,再灌注24小时后处死大鼠。原代培养的神经细胞取自孕16-18天SD大鼠胚胎,皮层和海马分开研磨、离心、计数后重悬培养于含血清的DMEM数天,之后分别用低血清、MG132和衣霉素处理。RT-PCR方法检测ER应激相关基因转录水平,Western Blotting和免疫荧光检测相关蛋白的表达水平及细胞内分布。用PI染色法鉴别死细胞。　　结果:　　1.星形胶质细胞中MANF的表达　　用荧光双标法检测大鼠脑组织星形胶质细胞中MANF的表达, GFAP和NeuN分别是星形胶质细胞和神经元的标志蛋白。在正常大鼠大脑皮层,MANF主要在NeuN阳性细胞表达,而星形胶质细胞中不表达。轻度脑缺血时,GFAP阴性细胞中MANF表达上调。然而重度脑缺血可诱导星形胶质细胞表达MANF。5％血清培养的正常星形胶质细胞中MANF几乎不表达。然而ER应激时,包括衣霉素、MG132和无血清培养,MANF可被诱导表达。通过RT-PCR和Western Blotting检测MANF的蛋白和mRNA水平,结果表明脑组织中神经元是MANF的主要来源,星形胶质细胞在ER应激刺激下可表达MANF。　　2.小胶质细胞中MANF的表达　　为了观察小胶质细胞中MANF的表达情况,用小胶质细胞的标志性蛋白CD68的单抗和MANF的单抗进行免疫荧光双标。结果发现,在正常脑组织中有少量CD68阳性的细胞中有MANF表达,而正常的星形胶质细胞中没有检测到MANF的表达。另外MANF的表达与小胶质细胞的形态有关,例如杆状或静止状态的网状小胶质细胞不表达MANF,阿米巴样或圆形的小胶质细胞表达MANF。在缺血的脑组织中,散在的小胶质细胞中MANF免疫反应阳性;而皮层和海马中聚集的小胶质细胞中无MANF表达。这些结果表明:MANF在小胶质细胞中的表达不仅依赖于其形态,而且与小胶质细胞的状态有关。在体外培养的小胶质细胞中也检测到MANF的表达。5%血清培养的小胶质细胞呈杆状或网状,几乎不表达MANF。衣霉素处理24小时后,小胶质细胞变成阿米巴样或圆形,此时小胶质细胞中MANF表达上调。　　3. MANF在少突胶质细胞中的表达　　在正常大脑皮层中的少突胶质细胞呈现分枝状,且胞体很小,CNP分布在放射状的树突和轴突。脑缺血时MANF在胞体表达,而树突和轴突表达减少。DAPI双标检测到细胞核中有少量的MANF。与星形胶质细胞和小胶质细胞相同的是衣霉素处理后少突胶质细胞中MANF表达上调。这个结果表明脑缺血和ER应激均可诱导少突胶质细胞中MANF的表达。　　4.原代培养的胶质细胞中MANF的表达　　Bip和CHOP是ER应激的标志物。用衣霉素、MG132和营养剥夺均可诱导原代培养的神经胶质细胞表达MANF。Bip和CHOP的mRNA和蛋白均被上调,而无血清培养对CHOP蛋白水平作用较小。该结果提示,胶质细胞可被诱导出现ER应激及MANF表达。同时,PI染色和DAPI染色结果显示,衣霉素、MG132处理和无血清培养可引起PI阳性细胞增加,提示ER应激可诱导细胞死亡。　　结论:　　以上研究结果表明,在脑组织中,仅有少量的胶质细胞可表达MANF,神经元是表达MANF的主要细胞群体,但各种刺激均可诱导胶质细胞出现ER应激和上调MANF的表达。