第一部分T2DM大鼠及十二指肠空肠旁路术动物模型的建立及评价背景糖尿病(diabetes Mellitus)是一组由于胰岛素分泌缺陷和／或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。在我国患病人群中,以2型糖尿病(Type 2diabetes Mellitus, T2DM)为主,根据世界糖尿病联盟(IDF)收集了91个国家的糖尿病患病资料结果显示：2010年糖尿病的预计患病率为6.4%(2.85亿),而到了2030年将升至7.7%(4.39亿),其中发达国家糖尿病患者将增加20%,发展中国家将增加69%。虽然通过改变生活方式,例如饮食控制、体育锻炼、减轻体重、禁烟等方法并配合一定的药物治疗,对预防及控制糖尿病也有一定的效果,但由于患者需终生服药,大部分患者依从性较差,长期维持血糖稳定效果并不理想。减重手术近年来越来越引起人们的重视,研究发现通过手术减重的同时可明显改善肥胖症患者的全身伴随症状,例如：高血压、高血脂、糖尿病等相关代谢性疾病。而且研究表明,减重手术不单纯依靠减重来缓解T2DM,尚存在其他不依赖于减重的抗糖尿病作用机制。目前已有大量的临床研究及动物实验证实了减重手术对T2DM有明显的改善作用,对减重手术治疗糖尿病的机制研究已成为当前热点问题,但其具体机制尚无定论。目的本研究通过对T2DM大鼠实施十二指肠空肠旁路术(Duodenal-jejunal bypass, DJB),进而研究其不依赖于减重作用的抗糖尿病机制。本实验主要探讨以下问题：(1)评估T2DM大鼠模型,保证该模型与人类T2DM的相似性；(2)检测DJB对T2DM大鼠模型糖代谢的影响,证明其对糖代谢具有改善作用；(3)观察DJB对本T2DM大鼠模型血脂指标的影响；验证其对血脂代谢具有改善作用；(4)观察DJB对肠道激素的影响,进一步分析其改善糖代谢的作用机制。(5)监测DJB术后血清胆汁酸浓度的变化,分析其与糖代谢指标的相关性。方法首先选取Sprague Dawley大鼠用高脂饲料喂养1个月,诱导其产生胰岛素抵抗,然后给予(35mg/kg)的链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射,破坏胰岛细胞诱导糖尿病的发生,此模型很好的模拟了人T2DM的发病过程及代谢特点。对成功诱导的T2DM大鼠随机分组后分别进行DJB手术及假手术(Sham-DJB, S-DJB),并设置空白对照组(CON),检测以下指标：(1)血糖：每周检测其空腹血糖；(2)糖耐量：术后进行口服葡萄糖耐量实验(Oral glucose tolerance test, OGTT); (3)胰岛素敏感性：术后进行胰岛素耐量实验(Insulin tolerance test, ITT); (4)胰岛素水平：术后检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平；(5)肠道激素：术后检测胰高血糖素样肽-1 (Glucagon-like peptide-1, GLP-1)、肽YY (Peptide YY, PYY)及葡萄糖依赖性促胰岛素肽(Glucose dependent insulinotropic peptide, GIP); (6)血脂及肝功指标：检测术后血清甘油三酯、总胆固醇、游离脂肪酸水平及ALT和AST。(7)术后血清胆汁酸水平及其与血糖、胰岛素及肠道激素的相关性分析。结果(1)高脂饮食联合小剂量STZ可成功诱导T2DM大鼠模型(2)DJB组大鼠术后的体重及能量摄入与S-DJB组、CON组比较与均无统计学差异(*P>0.05)。(3)与S-DJB组比较,DJB组术后空腹血糖迅速下降至正常水平,S-DJB组大鼠的空腹血糖逐步升高。(4)与S-DJB组比较,DJB组术后2周糖耐量明显改善(AUCOGTT明显下降,*P<0.05)。(5)相比S-DJB组,DJB组大鼠术后2周胰岛素敏感性有明显改善(AUCITT明显下降,*P<0.05)；在术后4周DJB组大鼠胰岛素敏感性有一定的上升,但两组大鼠的AUCITT差异仍然显著。(6)DJB组大鼠术后第2周、16周葡糖糖刺激的胰岛素分泌水平与S-DJB组和CON组比较显著升高(*P<0.05)。(7)与S-DJB组比较,DJB组大鼠术后2周及16周葡糖糖刺激后GLP-1、PYY水平明显升高(*P<0.05)。(8)DJB组术后甘油三酯及游离脂肪酸(FFA)水平较S-DJB组大鼠显著降低(*P<0.05)。(9) 与S-DJB组比较,DJB术后大鼠的血清胆汁酸水平显著升高,且胆汁酸变化与胰岛素水平、及肠道激素GLP-1水平呈显著正相关,与空腹血糖变化存在显著负相关。结论(1)通过高脂饲料喂养及联合STZ(35mg/kg)可以成功诱导T2DM大鼠模型；(2)DJB可迅速、有效、持久的改善T2DM大鼠的空腹血糖；(3)DJB能有效改善T2DM大鼠的糖耐量及胰岛素敏感性；(4)DJB能明显提高葡萄糖刺激后的GLP-1、PYY的分泌,但对GIP的分泌量无明显影响；(5)DJB能有效降低T2DM大鼠模型的FFA及甘油三酯水平；(6)DJB可导致血清胆汁酸浓度显著升高,且胆汁酸变化与血糖、胰岛素、及肠道激素变化存在显著相关性。该部分实验结果表明,DJB能有效改善T2DM大鼠模型的糖代谢,并观察到肠道激素GLP-1、PYY水平的升高及血清胆汁酸水平升高。且胆汁酸升高水平与糖代谢指标和肠道激素水平变化具有相关性。我们推测DJB可能是通过某种与胆汁酸相关途径影响GLP-1、PYY等肠道激素水平的变化,从而最终改善T2DM大鼠模型的糖代谢。在下一步的研究中,我们将对其作用机制进行进一步的研究。第二部分十二指肠空肠旁路术后T2DM大鼠胆汁酸水平升高机制的研究背景胆汁是由大多数脊椎动物的肝细胞所分泌出来的一种绿黄色而带有苦涩味的碱性液体。成分复杂,其核心组分是胆汁酸。胆汁酸主要存在于肠肝循环系统,它在肝脏合成,分泌入胆汁后进入肠道,参与食物和脂质的消化吸收过程,最后在回肠末端重吸收入血,经门脉系统重新进入肝脏,只有小部分经肠道排出。近年来研究表明胆汁酸可通过激动肝脏和肠道的TGR-5和FXR α受体,促进肝脏糖原合成、抑制糖异生,在改善糖代谢过程中起重要作用。对DJB的临床及动物实验研究发现,DJB术后血清胆汁酸浓度显著升高,且胆汁酸各组分比例也发生了明显的改变,但其具体机制尚不清楚。我们推测DJB可能通过解剖结构的改变导致胆汁酸合成或重吸收的改变,从而引起血清胆汁酸浓度升高,进而通过激活肝脏和肠道的胆汁酸感受器促进肝脏糖原合成、抑制糖异生,最终改善机体糖代谢水平。目的前期实验已证实DJB术后机体的血液中胆汁酸浓度升高,而且胆汁酸浓度升高与糖代谢的改善呈正相关。血液中胆汁酸浓度升高可以激活肝脏和肠道的胆汁酸感受器促进肝脏糖原合成、抑制糖异生,在调节胰岛素敏感性方面发挥着至关重要的作用,但胆汁酸升高的原因目前尚未清楚,为明确其升高原因,我们在本部分研究中对末端回肠的胆汁酸转运体和肝脏中胆汁酸合成的关键酶的蛋白表达进行检测,从胆汁酸的合成和重吸收两个方面进行研究,以明确DJB术后血庆胆汁酸升高的具体机制。方法应用第一部分实验中取得的组织样本,以Western blot技术对DJB术后肝脏组织中胆固醇关键合成酶-胆固醇7a一羟化酶(CYP7A1)、氧化甾醇27a羟化酶(CYP27A1)的表达进行检测；以免疫组化技术对回肠末端组织中胆汁酸主要转载体钠依赖性胆汁酸转运体(ASB T)及回肠胆汁酸结合蛋白(IBABP)的表达进行检测。结果(1)与S-DJB组相比,DJB组肝脏组织中CYP27A1表达有所下降,但并未达到显著性差异(P>0.05),CYP7A1的表达无明显变化(P>0.05)。(2)与S-DJB组相比,DJB组大鼠回肠末端组织中ASBT和IBABP表达显著升高(*P<0.05)。结论本部分的实验结果表明：(1)DJB手术后T2DM大鼠肝脏组织中胆汁酸合成酶表达无明显变化,证明胆汁酸的升高并不是因为胆汁酸合成的增加引起的。(2)DJB手术后T2DM大鼠回肠末端的胆汁酸转运体以及胆汁酸结合蛋白表达量均增加,证明胆汁酸在回肠的重吸收增加。DJB术后血清胆汁酸水平升高并不是合成增加,而是重吸收增加的结果第三部分十二指肠空肠旁路术后胆汁酸升高对糖代谢影响机制的研究背景近年来,胆汁酸在代谢过程中的作用越来越引起学者们的重视,它可以作为一种代谢过程中的重要细胞因子,与多种受体结合,发挥调节糖脂代谢的作用。法尼醇X受体(Farnesoid X receptor alpha, FXR α)是胆汁酸的一个重要的受体,主要在肝脏和肠道表达,FXR α广泛参与碳水化合物和脂类代谢的调节。FXR α在肝脏可以通过SHP感受并抑制胆汁酸形成,还可以通过SHP改变肝脏胆汁酸转运体BSEP和NTCP的结构促进胆汁酸分泌和减少再摄取。FXR α在小肠中活化可诱发成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)-19/15的表达和分泌。表达的FGF19／15分泌进入血液循环不仅能调控胆汁酸的从头合成,还具有促进肝脏糖原合成,降低血糖的类胰岛素作用。G蛋白偶联受体(TGR-5)是胆汁酸的另一个关键受体,在肝脏、小肠、褐色脂肪组织中表达,研究发现人体内TGR-5受体激动剂TNT-777能诱导GLP-1分泌。其机制是增加细胞内cAMP的水平,,改变ATP/ADP比率,造成钙内流。胆汁酸及其半合成衍生物可以通过激活末端回肠L细胞胞膜上的胆汁酸感受器TGR-5促进GLP-1的分泌,而GLP-1可以促进胰岛素分泌,促进β细胞增殖并抑制其凋亡,从而改善糖代谢。我们在前期试验已经证明DJB术后胆汁酸水平升高,且升高水平与血糖、胰岛素及GLP-1的变化呈相关性。而且我们进一步证明血清胆汁酸的升高主要是重吸收增加所致,综合上述分析,我们推测胃旁路术通过肠道解剖结构的改变加快胆汁酸与末端回肠的接触,导致胆汁酸重吸收增加,激活胆汁酸肝肠感受器FXRα及TGR-5,进而使GLP-1和FGF19/15的分泌增加而改善机体糖代谢。目的我们在前期实验中已证实DJB术后机体的血液中胆汁酸浓度升高,而且胆汁酸浓度升高与糖脂代谢有相关性。胆汁酸浓度升高可以激活肠-肝循环的胆汁酸感受器促进肝脏糖原合成、抑制糖异生,在调节胰岛素敏感性及影响糖脂代谢方面发挥着至关重要的作用。为验证DJB术后通过胆汁酸升高进一步改善糖代谢的理论,我们在本部分研究中对肝脏和回肠的FXR α、TGR-5蛋白表达进行检测,同时对肝脏糖原合成和糖异生的关键酶PEPCK、G6Pase表达水平进行检测。以明确DJB术后胆汁酸浓度升高影响糖脂代谢的可能机制。方法应用第一部分中取得的组织样本,以免疫组化技术对DJB术后肝脏和回肠组织中FXRα的表达、肝脏组织中TGR-5的表达进行检测；以Western blot对磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)表达水平进行检测结果(1) 与S-DJB组相比,DJB组大鼠末端回肠组织中FXR α表达显著增加,而肝脏组织中FXR α的表达仅轻度增加;(2) 与S-DJB组相比,DJB组大鼠肝脏组织中TGR-5表达显著增加；(3) 与S-DJB组比较,肝脏组织中的PEPCK和G6Pase表达增加,有显著统计学差异。结论本部分的实验结果表明：(1)DJB组术后与S-DJB组相比,T2D M大鼠末端回肠组织中FXRα表达显著增加,肝脏组织中FXR α表达轻度增加,而肝脏组织中的P EPCK和G6Pase基因表达水平升高,表明胆汁酸改善糖脂代谢可能与肠道内胆汁酸-FXR α-FGF-19/15通路相关。(2)DJB手术后T2DM大鼠肝脏组织的TGR-5表达量增加,证明胆汁酸改善糖代谢可能是通过胆汁酸-TGR-5-GLP-1通路实现的。