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鸡球虫在宿主体内寄生具有明显的部位特异性,柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella,E.tenella)寄生于盲肠;堆型艾美耳球虫(Eimeria acervuliina,E.acervuliina)和早熟艾美耳球虫(Eimeria praecox,E.praecox)主要寄生于十二指肠和小肠前段;巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima,E.maxima)和毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix,E.necatrix)寄生于小肠中部;布氏艾美耳球虫(Eimeria brunetti,E.bruneti)与和缓艾美耳球虫(Eimeria mitis,E.mitis)寄生于小肠后段、直肠和盲肠近端区。目前的研究认为,球虫子孢子表面分子与鸡肠道上皮细胞形成配体-受体关系,从而介导侵入过程中的接触、识别等,进而决定宿主侵入和寄生部位特异性。但决定部位特异性的虫体配子和细胞表面受体尚不完全明了。本研究以寄生在小肠后段的和缓艾美耳球虫为研究对象,观察了和缓艾美耳球虫微线蛋白在侵入部位特异性中的作用。本研究对于阐明和缓艾美耳球虫寄生部位特异性的分子机制具有重要意义,也为和缓艾美耳球虫新型疫苗的研发提供多种候选抗原。1 和缓艾美耳球虫子孢子蛋白中与鸡小肠后段上皮细胞结合蛋白的鉴定提取了E.mitis子孢子可溶性蛋白,证实该子孢子蛋白可与鸡小肠后段上皮细胞结合。进一步用免疫共沉淀方法收集与鸡小肠后段上皮细胞结合的E.mitis子孢子蛋白,应用LC-MS/MS(nanoLC-QE)进行蛋白质谱鉴定,并对鉴定出的蛋白序列进行Gene ontology(GO)分析。分析结果表明,鉴定出的蛋白中有12个蛋白是与侵入相关的,包括微线蛋白、14-3-3蛋白、棒状体颈部蛋白、表面抗原、钙调蛋白等。共有91个蛋白被成功注释,其中有56个蛋白与结合活性有关(占总蛋白数61.54%),22个蛋白具有催化活性(占总蛋白数24.18%)。这些蛋白有可能在E.mitis侵入宿主细胞过程中发挥作用。这些研究结果为进一步了解E.mitis在侵入宿主细胞过程中的相互作用机制提供了基础,也为更好地阐明E.mitis的致病机理提供了依据。2 和缓艾美耳球虫微线蛋白3(EmiMIC3)的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出微线蛋白3(E.mitis microneme protein 3,EmiMIC3)基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiMIC3基因含有一个完整的开放阅读框,长3438 bp,编码1145个氨基酸,蛋白分子量约为124.9 kDa。序列分析表明EmiMIC3中含有9个微线黏附重复序列(MARs)。将扩增得到的EmiMIC3基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,表达重组蛋白rEmiMIC3。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiMIC3可被人工感染E.mitis的鸡血清识别,而E.mitis子孢子天然蛋白也可被抗rEmiMIC3大鼠血清所识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段均有表达EmiMIC3。以rEmiMIC3免疫鸡可引发高水平的特异性IgG抗体,促进IFN-γ、IL-10、IL-17和TGF-β分泌,提高CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiMIC3可显著提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。结果表明EmiMIC3可作为临床抗球虫的候选疫苗抗原。3 和缓艾美耳球虫微线蛋白2(EmiMIC2)的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出微线蛋白2(E.mitis microneme protein 2,EmiMIC2)基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiMIC2基因含有一个完整的开放阅读框,长2175 bp,编码724个氨基酸,蛋白分子量约为75.8 kDa。序列分析表明EmiMIC2中含有1个vWFA superfamily结构域和4个TSP1结构域。将扩增得到的EmiMIC2基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,表达重组蛋白rEmiMIC2。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiMIC2可被人工感染E.mitis的鸡血清识别,而E.mtis子孢子天然蛋白也可被抗rEmiMIC2大鼠血清所识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段均有表达EmiMIC2。以rEmiMIC2免疫鸡可引发高水平的特异性IgG抗体,促进IL-2、IL-4、IL-10和TGF-β分泌,提高CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiMIC2可显著提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。4 和缓艾美耳球虫微线蛋白etmic-2/7h(EmiEtmic-2/7h)的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出微线蛋白etmic-2/7h(E.mitis Etmic-2/7h,EmiEtmic-2/7h)基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiEtmic-2/7h基因含有一个完整的开放阅读框,长888 bp,编码295个氨基酸,蛋白分子量约为30.0 kDa。序列分析表明EmiEtmic-2/7h中含有1个Etmic-2 superfamily结构域。将扩增得到的EmiEtmic-2/7h基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,表达重组蛋白rEmiEtmic-2/7h。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiEtmic-2/7h可被人工感染E.mitis的鸡血清识别,而E.mitis子孢子天然蛋白也可被抗rEmiEtmic-2/7h大鼠血清所识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段均有表达EmiEtmic-2/7h。以rEmiEtmic-2/7h免疫鸡可引发高水平的特异性IgG抗体,促进IFN-γ、IL-2、IL-4和TGF-β表达,提高CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiEtmic-2/7h可显著提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。5和缓艾美耳球虫顶膜抗原1(EmiAMA1)的分子鉴定及免疫保护性研究从E.mitis子孢子中克隆出顶膜抗原1(E.mitis apical membrane antigen 1,EmiAMA1)基因,并分析其序列特征。扩增出的EmiAMA1基因含有一个完整的开放阅读框,长273 bp,编码90个氨基酸,蛋白分子量约为9.9 kDa。序列分析表明EmiAMA1中含有1个AMA-1 superfamily结构域。将扩增得到的EmiAMA1基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,表达重组蛋白rEmiAMA1。Western blot分析结果表明,重组蛋白rEmiAMAl可被人工感染E.mitis的鸡血清识别。免疫荧光染色试验结果显示E.mitis子孢子和裂殖子阶段都有表达EmiAMA1。以rEmiAMA1免疫鸡可引发高水平的特异性 IgG 抗体,促进 IFN-y、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17D 和 TGF-β 表达,提高 CD4+和CD8+T淋巴细胞比例。免疫保护试验结果显示免疫rEmiAMA1可显著提高动物体重增长,降低卵囊排出量和平均病变记分。6微线蛋白其结构域在E.mitis子孢子侵入过程中的作用微线蛋白在艾美耳球虫侵入宿主细胞的早期阶段发挥了重要作用。在前期的研究中我们发现EmiMIC3是由9个串联的微线蛋白黏附重复结构域(Microneme adhesive repeat,MAR)组成的。为探究EmiMIC3及其包含的EmiMARs在E.mitis子孢子侵入宿主细胞过程中的作用,我们分别克隆并表达了 EmiMIC3及EmiMARs蛋白。免疫荧光分析结果表明EmiMIC3可与鸡小肠后段上皮细胞结合。细胞ELISA分析结果表明EmiMARs均可以和鸡小肠后段上皮细胞结合,但其中EmiMAR4的结合能力是最强的。鸡不同部位肠道免疫组化分析结果表明,EmiMIC3可以特异性结合小肠后段,而不结合其他肠段。而EmiMIC2,EmiEtmic-2/7和EmiAMA1与所有的肠段都不结合。EmiMIC3中只有EmiMAR4可与小肠后段结合,而不与其他肠段结合。此外,体外、体内试验均表明抗EmiMIC3血清可显著抑制E,mitis子孢子侵入宿主细胞。因此,EmiMIC3及其所包含的EmiMARs在E.mitis子孢子侵入过程以及寄生部位特异性方面发挥重要的作用。