论文部分内容阅读
草莓属(Fragaria)植物为蔷薇科(Rosaceae)、蔷薇亚科(Rosoideae)、委陵菜族(Potentilleae)、草莓亚族(Fragariinae),全世界草莓属约24个种,主要分布在亚洲、欧洲和美洲。栽培草莓(F.×ananassa),又叫凤梨草莓,是一个八倍体人工种,其色泽艳、营养高、风味浓、效益好而备受栽培者和消费者的青睐。叶绿体基因组不受倍性影响,且为母系遗传,可为植物系统发育提供分子信息。鉴于此,本课题首次利用高通量测序技术,开展了栽培草莓叶绿体全基因组测序、基因组图谱绘制、蔷薇科特别是草莓属植物叶绿体基因组比较分析以及草莓属植物叶绿体基因组分子标记开发等方面的研究。主要研究结果如下:1、利用高盐-低pH的缓冲液结合Percoll密度梯度离心分离纯化栽培草莓‘红颊’(F.×ananassa‘Benihoppe’)叶绿体,再用SDS-蛋白酶K法提取叶绿体DNA(cpDNA)。该方法分离的草莓叶绿体完整性高,叶绿体DNA质量好,纯度高,能够满足后续基因组测序等实验的基本要求。2、利用Illumina高通量测序技术,对栽培草莓‘红颊’进行叶绿体全基因组测序,绘制了栽培草莓叶绿体基因组图谱。‘红颊’叶绿体基因组大小为155,549bp,具有典型的四分体结构:85,531 bp大单拷贝区(LSC,Large single copy)和18,146 bp小单拷贝区(SSC,Small single copy)被一对 25,936 bp 反向重复区(IR,Inverted repeat)分开。全基因组共编码130个基因,其中18个基因位于一对IR区,即均具2个拷贝,这112个基因包括78个蛋白编码基因,30个转运RNA(tRNA)基因和4个核糖体RNA(rRNA)基因,基因类型及其排列顺序与已公布的草莓属其他植物叶绿体基因组完全一致。此外,还鉴定出39个重复序列和61个SSR。将该栽培草莓叶绿体全基因组序列与蔷薇科其他植物进行全序列比对,结果是蔷薇科植物IR区普遍比SC区(Single copy)更为保守;大多数叶绿体基因的Ka/Ks值小于1,这些基因具纯化选择作用;3 个八倍体草莓(F.×ananassa‘Benihoppe’,,F.chiloensis(GP33),F.virginiana(O477))叶绿体基因组序列高度相似,同时3个物种的全基因组序列也存在大量的SNPs 和 InDels。3、利用10个草莓属植物叶绿体基因组序列,开发出6个叶绿体基因组分子标记,分别是 ndhE-ndhG 区,atpF-atpH区,trnR-atpA 区和rps2-rpoC2区以及 ndhJ、rbcL基因。利用上述6个分子标记对19份草莓属种质进行了验证和比较分析,结果是6个标记在19份资源上均有扩增,但琼脂糖凝胶无法分辩不同的扩增产物。通过测序分析,6个标记依次检测到3、5、13、7、3、21个变异位点,简约信息位点分别为2、3、9、6、2、20个,具有较高的多态性。6个标记序列共生成13个单倍型,单倍型多态性(Hd)和核苷酸多样性指数(Pi)分别为0.953和0.00514;总变异位点数50个,其中41个为信息位点。UPGMA聚类分析得出各个标记对参试材料的聚类结果存在一定差异,6个标记序列综合聚类可将供试草莓属各种基本区别开(自展值大于80%),且蛇莓(Duchesnea indica)单独形成1个分支。6个分子标记在草莓属种质鉴定方面具有一定的应用价值。