Pde4d基因位于小鼠13号染色体，该基因的编码产物是磷酸二酯酶超家族（Phosphodiesterase，PDE）成员之一。因其专一性水解细胞内的环腺苷酸（cAMP），可在cAMP/CREB和cAMP/EPAC细胞信号通路中发挥重要的作用。有研究指出，Pde4d是一个父本偏好的基因，并对遗传疾病和肿瘤发生有重要的影响，但是此研究中的SNP位点不能准确反映Pde4d的印记特点，且该基因与胚胎发育的关系并不十分清楚。因此，本文通过PCR产物直接测序法对Pde4d基因座在发育中的印记特点进行分析；通过了解Pde4d在胚胎发育中的表达模式与调控特点，揭示其在胚胎发育中的潜在功能；并以骨髓间充质干细胞MS-K为研究模型，探讨PDE4D对MS-K细胞增殖和迁移的影响，旨在揭示该基因可能在胚胎发育中具有的作用。本研究为明确Pde4d在小鼠胚胎发育中的印记特点，首先利用生物信息学对Pde4d基因座进行分析。研究发现，Pde4d印记报道中的SNP位于内含子中的转录单元-AK046832内部，表明AK046832具有父本表达偏好的印记特点。同时分析发现，基因座内部存在两个CpG岛（CGI1和CGI2）在发育过程中甲基化状态发生了明显改变，暗示CGI1和CGI2对Pde4d基因座的印记表达具有潜在的调控作用；其次，印记分析发现，Pde4d、AK046832和miR-1904具有不同的印记方式，Pde4d在E9.5天全胚胎及胎盘中具有父本偏好的表达特点，但在E15.5天的主要脏器及胎盘中呈现出双等位表达，而AK046832和miR-1904在发育过程中表现为双等位表达。这些结果表明，Pde4d在胚胎发育过程中是一个印记模式动态变化的基因。由于Pde4d在小鼠胚胎发育中的时空表达特点还不清楚，故本研究通过实时定量PCR（qRT-PCR）以及RNA原位杂交技术对该基因在胚胎和胎盘中的表达谱进行分析。qRT-PCR结果显示，在胚胎早期发育中，Pde4d的表达水平从2-细胞到桑椹胚阶段呈现下降趋势，而在囊胚中显著降低；在中后期（E9.5-E18.5）胚胎内，该基因表达升高；Pde4d在胎盘中表达稳定并且仅在发育后期表达上调。原位杂交分析发现，Pde4d主要在中期（E9.5-E11.5）胚胎的神经系统以及体节中高表达，在器官形成阶段（E12.5-E15.5），表达信号广泛存在于除心脏外的主要脏器内；在胎盘发育过程中，Pde4d的表达具有动态变化的特点，在E11.5天胎盘中，Pde4d明显表达在成胶质细胞层以及迷路层，在E12.5-E15.5天，Pde4d在迷路层的表达信号减弱，而在成胶质细胞层内表达增强。发育至E16.5天，位于蜕膜层内Pde4d的表达信号开始增强，随着胎盘的进一步发育，在E17.5-E18.5天胎盘的三层结构中能明显检测到Pde4d的表达信号。以上结果显示，Pde4d在胚胎和胎盘发育中是一个动态变化且广泛表达的基因。根据Pde4d基因座启动子和内含子转录单元的特点，本研究主要对DNA甲基化及内含子miRNA的调控方式进行分析。研究表明，Pde4d启动子区内的CpG位点以组织特异性甲基化的方式影响E15.5天脏器内Pde4d的表达水平；同时，在肝脏组织内，启动子区内的CpG位点以发育阶段特异性甲基化的方式影响基因的表达。通过5-aza-cdR对细胞进行去甲基化处理，进一步证明Pde4d启动子区内的DNA甲基化与基因的表达水平相关；此外，通过生物信息学预测及荧光素酶报告基因系统验证，内含子中的miR-1904能够靶向其宿主基因Pde4d，在细胞中过表达miR-1904会抑制Pde4d蛋白水平的表达，故内含子miR-1904能够直接调控Pde4d的表达。因此，该结果表明基因启动子的甲基化及内含子miR-1904是调控Pde4d表达的重要因素。为进一步解析Pde4d基因的功能，本研究分析了短亚型PDE4D1及长亚型PDE4D7对细胞增殖和迁移能力的影响。研究结果表明，过表达PDE4D1和PDE4D7能显著抑制MS-K细胞增殖及克隆形成，并引起细胞内Cyclin D1的表达上调，从而导致细胞G1期缩短，提前进入S期；其次，两个亚型均显著降低MS-K细胞的迁移与铺展能力，并且发现Vinculin基因表达上调，Integrin β1基因表达下调；再次，两个亚型引起了MS-K细胞与增殖和迁移相关基因表达的下调；最后，体内细胞移植实验表明，PDE4D7的过表达对MS-K细胞的生长具有显著的抑制作用。以上结果均表明，PDE4D1和PDE4D7在体内和体外都能显著抑制MS-K细胞的增殖和迁移能力。综上所述，Pde4d是一个在胚胎发育中印记模式动态变化并广泛表达的基因，其启动子区的甲基化与内含子miR-1904是调控Pde4d表达的重要因素，并且Pde4d的过量表达能显著改变MS-K细胞增殖和迁移的能力，揭示Pde4d在胚胎发育中具有潜在的重要功能。