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真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein,FIP)是一种结构和功能与植物凝集素和免疫球蛋白重链可变区相似,具有凝集血红细胞、促进人外周血淋巴细胞增殖和刺激免疫细胞产生多种细胞因子等免疫调节活性的小分子蛋白质。由于其具有免疫活性高,有效浓度低,成分单一易于纯化等优势而拥有良好的临床应用前景和药用保健价值。虽然各种FIPs之间在一级结构、二级结构和高级结构上都具有一定的相似性,并具有相似的生物学功能。然而,不同的FIPs在某些生物活性方面表现也有所不同。因此,在真菌中挖掘新型FIPs,将为探索具有更多生物功能或更高免疫调节活性的药用蛋白提供丰富的生物资源,并为其开发为一种新型药品或功能食品提供有价值的理论基础和应用依据。本文以灵芝免疫调节蛋白LZ-8为模板,在草菇(Volvaria volvacea)基因组中进行BLAST比对发现与LZ-8相似性在60%以上的7种FIP,除Fip-vvo为已报道的草菇免疫调节蛋白以外,其它6种FIP均为新型的真菌免疫调节蛋白,我们将其分别命名为FIP-vvo77,FIP-vvo78,FIP-vvo79,FIP-vvo80,FIP-vvo82,和Fip-vvo98。首先,通过生物信息学方法,将这些新型FIP与已知的真菌免疫调节蛋白在生理生化性质、亚细胞定位、信号肽、遗传进化等方面进行比较分析,从而预测新型FIP的活性。然后,在体外构建工程菌,诱导表达新型FIPs及纯化,得到目的蛋白,检测新型FIP的免疫调节活性和促进细胞凋亡活性,并从分子水平研究新型FIP对Hela、A549和Spca-1细胞凋亡通路的影响,筛选出生物活性较好的FIP,为后续开发和应用研究提供重要的理论依据。具体结果如下所示::1.7种新型真菌免疫调节蛋白均由约113个氨基酸残基组成,不含半胱氨酸(Cys),富含缬氨酸(Val)和络氨酸(Tyr)。相对分子质量为12-13k D,理论等电点p I从6.06到8.83。经过比较发现FIP-vvo82的不稳定系数(II)最高(20.77),就此推测FIP-vvo82与其他新型FIPs相比,柔性较好,可能具有较高活性,并通过分子模拟方法预测FIP-vvo82产生高活性的分子机理。2.检测7种草菇免疫调节蛋白刺激免疫细胞分泌白介素-2,实验结果为新型真菌免疫调节蛋白FIP-vvo82的免疫活性最高,这与生物信息学分析结果相一致。3.检测了6种新型FIPs(FIP-vvo78、79、80、82、98以及FIP-vvo)对Hela、A549和Spca-1细胞活力和促凋亡的影响。结果表明,FIP-vvo82对Hela、A549和Spca-1细胞的促凋亡效果较为明显,其中对Hela和A549细胞促凋亡效果最为明显,凋亡率分别为63.4%和54.8%,FIP-vvo-79、FIP-vvo-80和FIP-vvo-97对Spca-1细胞促凋亡效果较为显著,凋亡率分别为:73.4%、73%和71.3%。4.检测了6种新型FIPs(FIP-vvo78、79、80、82、98以及FIP-vvo)对Hela、A549和Spca-1细胞凋亡信号通路的影响。结果表明,7种新型FIPs通过阻碍线粒体膜电位(MMP)的生成,减少凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl量,提高Caspase-3的活性,提高细胞色素C(Cyto C)从线粒体释放的强度,从而促进肿瘤细胞的凋亡。