研究背景纳米材料是由纳米颗粒所构成的材料。纳米颗粒的定义是单个颗粒的三维尺寸中至少有一个维度的尺寸在1～100 nm的材料。由于颗粒直径小,纳米材料具有了大块固体材料所不具备的多种理化特性,也因此被广泛用于工业生产的各个领域。但纳米材料本身并非完全无害的。随着纳米材料应用范围的扩展,相关领域的学者也开始关注其生物安全性问题。大量的实验研究显示纳米材料在研发、生产以及应用的过程中,纳米颗粒可进入水体、土壤等自然环境,再通过多种途径进入人体,经血液循环进入组织器官和细胞中,进而产生一系列的损伤效应[1]。纳米氧化锆材料在口腔医学领域也有广阔的应用空间。通过使用纳米氧化锆对传统口腔材料进行改性,可极大的改善传统材料的性能[2-4]。但作为纳米材料,纳米氧化锆的生物安全性问题同样值得关注。然而,现有文献关于纳米氧化锆的毒性研究十分有限。本研究拟建立纳米氧化锆颗粒的体内染毒模型,通过电感耦合等离子体质谱技术,分析纳米氧化锆颗粒在心、脾、肺、肾中的分布及代谢规律;通过血清中炎症因子指标的变化分析颗粒对脾脏的影响;通过组织病理技术、生物化学技术进一步分析其对脾脏的毒性作用,为纳米氧化锆的毒性研究提供新思路。研究目的:(1)建立纳米氧化锆颗粒急性染毒模型,观察颗粒在大鼠体内的分布情况。(2)通过血清中炎症因子指标的变化分析纳米氧化锆对脾脏的影响。(3)研究纳米氧化锆对大鼠脾组织的损伤作用。(4)探究纳米氧化锆对脾脏毒性作用的机制。材料与方法:第一部分:纳米氧化锆颗粒的表征(1)透射电子显微镜检测纳米原始粒径及形态。(2)电位测定仪检测纳米氧化锆颗粒在混悬液中的电位值及水合粒径。(3)能谱分析仪检测纳米颗粒的化学元素构成。(4)氮气吸附实验检测纳米颗粒的比表面积。第二部分:锆元素的体内分布及血清中炎症因子含量的分析(1)构建动物模型模型构建前选用0.9%的无菌生理盐水将纳米氧化锆颗粒分散均匀并配置颗粒混悬液,然后对6周龄的雄性wistar大鼠进行混悬液的单次尾静脉注射处理(20 mg/kg b.w.)。(2)锆元素的生物学分布在给药后的第1 d、7 d、14 d,分别收集对照组和实验组大鼠的心、脾、肺、肾组织,经浓硝酸与H202消解后,采用电感耦合等离子体质谱分析检测各样品中锆元素含量。(3)血清中炎症因子含量的分析在给药后的第1d、7d、14d,分别收集对照组和实验组大鼠的血清,参照液相蛋白分析试剂盒说明准备样品及标准品,采用液相蛋白分析仪测定血清中炎症因子的含量。第三部分:纳米氧化锆对脾组织的损伤研究(1)脾组织的病理学观察收集对照组7d与实验组7d、14d大鼠的新鲜脾组织(n=3),浸泡于4%的中性甲醛溶液完全固定后,制作石蜡切片。采用常规的苏木精伊红染色观察脾组织的结构变化。(2)脾组织的免疫组织化学染色观察进行常规苏木素伊红染色的同时,分别采用Ki-67与末端标记法凋亡染色技术观察脾组织的增殖与凋亡情况。第四部分:纳米氧化锆毒性作用的机制研究(1)组织匀浆的制备与总蛋白含量的测定分别收集实验组(1d、7 d、14 d)和对照组(1d、7 d、14 d)大鼠的脾组织,用组织匀浆机制备组织匀浆,离心收集后稀释至所需浓度。根据总蛋白定量试剂盒的说明,检测匀浆中的蛋白含量。(2)氧化应激相关酶活性的检测同样使用实验组(1d、7 d、14 d)和对照组(1d、7 d、14 d)大鼠脾组织所制备的匀浆。按超氧化物歧化酶试剂盒之操作说明完成检测样品制备。采用荧光酶标仪测定样品OD值,并计算出组织中超氧化物歧化酶的活性。(3)脂质过氧化产物的含量检测使用适当浓度的组织匀浆,按照丙二醛试剂盒之操作说明制备检测样品。样品经水浴加热后反应完全,测定样品OD值,并计算丙二醛含量。结果:第一部分:透射电子显微镜观察结果显示纳米氧化锆颗粒近似球形,原始粒径平均约为38 nm。电位测定仪显示纳米颗粒在水溶液中的电动电位为30.6 mV,水合粒径约为181.2 nm。能谱仪结果示纳米颗粒的元素组成符合氧化锆的特点,无其他杂质。氮气吸附实验结果示纳米氧化锆颗粒的比表面积为33.06 m2/g。第二部分:生物学分布检测结果显示,锆元素在对照组大鼠的心、脾、肺、肾组织中未检出,在实验组大鼠的心、肾组织中未检出,实验组大鼠脾、肺组织中的含量显著高于对照组。分析实验组脾、肺组织中锆元素的含量变化,脾组织中锆元素的含量14 d>7d>1d,提示锆元素含量随时间累积而逐渐升高。肺组织中锆元素的含量7 d>1 d=14 d,锆元素含量先升后降。血清中IL-1α的含量,实验组7 d显著高于对照组(1d、7 d、14 d)与实验组(1d、14 d);血清中IL-1β含量,实验组1d显著高于对照组(1d、7 d、14 d)与实验组(7d、14d);血清中IL-2的含量各组无统计学差异;血清中IL-6的含量各组无统计学差异;血清中IL-12含量,实验组1 d显著低于对照组(1 d、7 d、14 d)与实验组(7 d、14 d);实验组7 d显著高于对照组(1d、7 d、14 d)与实验组(1d、14 d);对照组(1d、7 d、14 d)与实验组14 d间无统计学差异;血清中TNF-α的含量,实验组7 d显著高于对照组(1d、7 d、14 d)与实验组(1d、14d);实验组14d低于对照组(1d、7d、14d)与实验组(7d);对照组(1d、7 d、14 d)与实验组1d间无统计学差异。第三部分:苏木素伊红染色结果显示,实验组7 d、14 d动物脾组织相较对照组7 d无明显组织病理学改变,对照组7 d、实验组(7 d、14 d)的脾组织切片中均清晰可见白髓、红髓及脾小梁等正常结构。Ki-67染色结果,实验组7 d脾组织中细胞阳性率与对照组7 d无明显差异,但对照组7 d脾组织的红髓与白髓中可见阳性细胞分布规律,而实验组7 d的脾组织中阳性细胞主要集中于白髓中,红髓中少见阳性细胞分布,实验组14 d的细胞阳性率低于对照组7 d和实验组7 d。末端标记法凋亡染色结果示,对照组7 d脾组织中可见少量阳性胞,实验组7 d脾组织中的部分区域阳性细胞数多于对照组7 d,实验组14 d的阳性细胞比率与对照组7 d无差异。提示实验组7 d脾组织中部分区域凋亡细胞数目增加。第四部分:氧化应激相关酶活性检测结果显示,实验组1d、14 d的脾组织中超氧化物歧化酶活力较对照组显著下降(P<0.01)。表明给药后实验组动物脾组织中该酶的活性受到了损害;脂质过氧化产物的含量检测表明,丙二醛的含量在给药后的实验组动物中脾组织中未有明显改变。结论:1.纳米氧化锆颗粒可沉积于脾、肺组织中,并引起脾组织炎症反应和氧化应激。2.纳米氧化锆颗粒沉积可引起脾红髓细胞增殖减少、诱导脾组织细胞凋亡,引起功能损伤。3.纳米氧化锆颗粒在脾脏中随时间而逐渐沉积,并至少可维持14 d。4.纳米氧化锆颗粒对脾脏损伤的机制与氧化应激密切相关。