【摘 要】
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番茄环斑病毒为中国一类检疫对象,国内目前无标准的分子生物学检疫程序,该实验应用一对根据ToRSV RNA RDRP基因序列设计的引物,对两个不同的番茄环斑病毒分离物(苹果分离物
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番茄环斑病毒为中国一类检疫对象,国内目前无标准的分子生物学检疫程序,该实验应用一对根据ToRSV RNA<,1> RDRP基因序列设计的引物,对两个不同的番茄环斑病毒分离物(苹果分离物和加拿大分离物)进行了RT-PCR扩增,结果均得到特异的449nt扩增产物.这在国内属首次利用一对引物同时检测到两个不同的ToRSV分离物.将此449nt的PCR产物克隆到质粒载体pGEM-3Zf(+)上,获得了带有此PCR产物插入片段的上述两个分离物的克隆.将其中加拿大分离物的克隆进行序列分析,比较其与报道的相应序列的同源性达86.7%.说明该分离物确是ToRSV的一个株系,且ToRSV各株系间核酸序列差异较大,也进一步证明了RT-PCR的正确性.将此克隆用SP<,6>RNA聚合酶在Dig-rUTP存在下经体外转录得到非放射性地高辛标记的cRNA探针,用此RNA探针分别与ToRSV两上不同分离物的感病植物组织总核酸提取物和PCR产物进行点杂交,经化学发光检测,结果表明它们均有特异性反应,说明应用此Dig-cRNA探针能成功地检测到ToRSV不同分离物.该实验建立了分子生物学方法检测番茄环斑病毒的标准程序,并已在国家动植物检疫局举办的"类病毒、植原体分子生物学检测技术培训班"中得到检验,证明是一种可靠、灵敏、快速、简便的检测方法.提高了中国植物检疫的水平.
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