B7分子表达在抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC)的表面,是重要的T细胞协同刺激分子,正常生理条件下,其与T细胞表面的CD28结合及传递适度的B7/CD28信号是启动T细胞免疫应答以及促进T细胞依赖的B细胞活化和功能发挥所必需的。在病理状态下,B7/CD28信号活化过度,致使T、B细胞功能亢进和异常免疫应答,从而导致自身免疫性疾病的发生。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性的自身免疫性疾病,患者机体免疫功能出现紊乱:T、B细胞等发生异常的免疫应答,促进多种自身抗体形成,进而出现免疫复合物在各种组织器官的沉积以及不可逆转性的炎症损伤。在SLE众多病理表现中,狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)最为常见,亦是严重威胁患者生命的主要并发症,尤其受到关注。研究表明,在LN的病理过程中B7/CD28协同刺激信号参与其中,该信号通路的过度活化及导致的T、B细胞功能亢进对于LN的发生发展具有重要的作用。通过特异性抗体结合及封闭B7分子在蛋白水平干预B7/CD28信号通路,可中断或者削弱T、B细胞的异常免疫应答以及恢复机体正常的免疫耐受,对于减轻SLE的病理损伤具有积极的意义。同样的,采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)的方式在基因水平上特异性的沉默B7基因,进而使得APC表面缺失或下调B7分子,也可以达到对B7/CD28协同刺激信号阻断或者抑制的目的,从而使T、B细胞等异常的活化与应答得到控制。本研究采用本科室前期所建立的分泌小鼠抗人B7-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,自行生产制备B7-2分子特异性抗体并对其进行体外生物学特性的鉴定,同时构建小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒并分析验证其对B7/CD28协同刺激信号的拮抗效应。与此同时,建立降植烷(Pristane)诱导的,与人类狼疮病理过程/症状类似的C57BL/6小鼠狼疮样肾炎模型,通过免疫细胞活化、自身抗体产生与免疫复合物沉积以及肾脏炎症损伤等指标检验模型的稳定可靠性。在前述基础之上,采用B7-2特异性抗体在蛋白水平及小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒在基因水平抑制B7/CD28协同刺激信号、影响SLE病理过程中APC-T细胞-B细胞的病理性连锁反应轴,对C57BL/6小鼠狼疮样肾炎模型实施整体免疫干预,通过免疫学、血清学及组织病理学等指标的动态检测与分析,探究对小鼠狼疮样肾炎形成和病理损伤的免疫干预效应以及相应的分子机制,同时对不同干预方式对狼疮小鼠肾脏病理损伤的缓解/逆转效应进行比较,以期为SLE疾病发生发展中免疫细胞活化及病理损伤的演变过程提供新的证据,同时为此类疾病寻找新的生物学干预手段。第一部分小鼠抗人B7-2分子功能性单克隆抗体的制备及生物学特性研究目的:制备小鼠抗人B7-2分子功能性单克隆抗体,并对其生物学特性进行研究。方法:运用小鼠抗人B7-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用诱生腹水法制备抗体;Protein G免疫亲和层析法纯化抗体;流式细胞术检测该抗体对不同种类细胞的膜型B7-2分子的识别能力;MTT法检测其对B7/CD28协同刺激信号的拮抗作用。结果:通过诱生腹水法进行抗体制备时腹水形成的阳性率约为80%,腹水的平均收获量为5.5m L/只小鼠,抗体蛋白的得率平均为2.5mg/m L腹水;该抗体能够识别L929-B7-2、Raji及小鼠脾脏细胞表面的B7-2分子,阳性结合率分别为94.5%、98.2%及52.7%;同时此抗体也能够拮抗B7-2介导的协同刺激信号以及显著抑制L929-B7-2刺激人外周血淋巴细胞的增殖效应(p<0.05)。结论:成功制备了B7-2分子特异性单克隆抗体,该抗体能够有效拮抗B7/CD28协同刺激信号。第二部分小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表达载体的构建及重组慢病毒的制备目的:构建小鼠B7-2基因RNA干扰慢病毒表达载体,并进行重组慢病毒的制备。方法:选择三段小鼠B7-2基因RNAi的靶序列,设计合成短发夹RNA的模板,将其克隆导入慢病毒表达载体,将筛选及鉴定的表达载体与慢病毒包装及包膜质粒通过脂质体法共转染293T细胞,从而包装生产重组慢病毒;重组慢病毒通过超速离心法进行浓缩;采用细胞生物学的方法进行滴度测定以及及复制型慢病毒的检测。结果:经测序鉴定,重组小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表达载体构建正确;通过慢病毒质粒共转染293T细胞包装制备了重组慢病毒;经超速离心获得了浓缩的慢病毒颗粒,经细胞生物学方法检测证实,病毒滴度达到1~3×108TU/m L,同时在重组慢病毒感染过程中无复制型病毒的产生,具有良好的生物安全性。结论:成功构建了分别针对三个不同靶点的小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒表达载体,并包装制备了具有良好生物安全性的高滴度重组慢病毒(LV-139/LV-425/LV-848)。第三部分小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒对树突状细胞膜型B7-2分子表达的干扰效应研究目的:依据对DC膜型B7-2表达干扰效应的差异,筛选出基因沉默效果最佳的重组小鼠B7-2基因RNAi慢病毒,并检测其对B7/CD28协同刺激信号的拮抗作用。方法:从C57BL/6小鼠中分离获得骨髓细胞,采用细胞因子(GM-CSF及IL-4)诱生法制备DC,应用脂多糖刺激48h促进成熟,同时通过对其生长形态、表面分子表达(CD11c、B7-1、B7-2及MHCⅡ)的检测进行鉴定;重组慢病毒LV-NC以不同感染复数(5,10,20,40,60)感染体外分离诱导的DC后,采用流式细胞术分析感染效率并确定最佳的感染条件;重组慢病毒LV-139、LV-425及LV-848以确定的感染条件感染DC,流式细胞术检测其对DC膜型B7-2分子表达的干扰效率并确定具有最佳干扰效果的小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒;MTT法测定小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒对B7/CD28协同刺激信号的拮抗作用和对DC刺激小鼠脾脏T细胞增殖的抑制效应。结果:成功分离诱导出小鼠骨髓源DC,其具有典型的树突状突起、表达CD11c(68.5%)及B7-1(71.6%)、B7-2(74.0%)、MHCⅡ(84.0%);经流式细胞术分析,重组慢病毒LV-NC可以有效感染DC,感染效率达到86.4%;重组慢病毒LV-139、LV-425、LV-848在感染复数为80时,对DC膜型B7-2分子表达的干扰效率分别为66.7%、67.2%及63.8%;经MTT法检测,重组慢病毒LV-425能够拮抗B7-2介导的协同刺激信号以及显著抑制DC刺激小鼠脾脏T细胞的增殖效应(p<0.05)。结论:小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒LV-425可有效拮抗B7/CD28协同刺激信号。第四部分小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定目的:建立降植烷(Pristane)诱导的小鼠狼疮样肾炎模型,并对其进行生物学鉴定。方法:C57BL/6小鼠(雌性,6~8周龄)经腹腔一次性注射Pristane 0.5m L/只进行模型的制备。建模后第10天,流式细胞术分析小鼠脾脏中Mφ、DC、粒细胞及B细胞活化状况以及B细胞表面B7-2、MHCⅡ的表达情况;每个月进行眼眶经脉丛定期活体取血以及血清中ANA及抗ds DNA抗体表达的间接免疫荧光分析;每月一次早晨收集小鼠新鲜尿液,应用Albustix试纸测定尿蛋白含量;建模后的第8个月时,直接免疫荧光法分析免疫复合物在肾脏中沉积的情况,HE染色检查肾脏病理损伤的状况。结果:1.建模后第10天,小鼠脾脏中CD11b+细胞(Mφ)、CD11c+细胞(DC)、Gr1+(粒细胞)以及CD21+细胞(B细胞)活化程度均出现上调,阳性率分别为7.35±0.60%3.78±0.26%、9.85±0.73%及20.94±1.24%,显著高于正常对照组(p<0.05);CD21+B细胞表面B7-2以及MHCⅡ的表达率也出现升高,分别为48.31±2.24%和67.15±3.62%,与对照组差异显著(p<0.05)。2.建模组部分小鼠3个月时血清中ANA和ds DNA出现阳性(阳性率:30%和10%),其阳性率和抗体滴度随着时间的推移而逐渐增加;至8个月时,模型组ANA检测结果均为阳性,ds DNA抗体的阳性率达89%。3.Pristane注射4个月后,30%的小鼠开始检测到蛋白尿的出现,尿蛋白含量在0.3~3g/L(+~++)之间,蛋白尿的阳性率和尿蛋白含量随时间推移而逐渐增加,监测至第8个月,全部的建模组小鼠蛋白尿阳性,尿蛋白含量在1~2g/L(++~++++)之间。4.经直接免疫荧光检测,8个月时,建模组小鼠肾脏中肾小球毛细血管、系膜区等处出现明显的免疫复合物沉积;HE染色以及组织病理学检查显示,模型小鼠肾小球体积增大,肾小球内及系膜区淋巴细胞侵润,部分肾小球血管袢变性坏死,肾小球囊腔增大。结论:建立了与人类狼疮表现类似的Pristane诱导的C57BL/6小鼠狼疮样肾炎模型。第五部分B7-2分子特异性抗体及RNAi重组慢病毒对小鼠狼疮样肾炎的免疫干预效应及分子机制研究目的:运用B7-2单克隆抗体和小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒抑制B7/CD28协同刺激信号,研究及比较不同方式对小鼠狼疮样肾炎模型的形成及病理损伤的免疫干预效应并探究其分子机制。方法:B7-2抗体早期干预组:在给予一次性腹腔注射0.5m L Pristane后,每只小鼠分别于第1、3、5、8、15天尾静脉注射200μg B7-2单克隆抗体,随后的3个月内每隔1个月注射一次;延迟B7-2抗体干预组:在建模4个月后,直到小鼠出现蛋白尿以及自身抗体时给予B7-2抗体进行干预,给药方式及剂量与早期B7-2抗体干预组相同;重组小鼠B7-2基因RNAi慢病毒干预组:每只小鼠分别于第1天和第60天尾静脉注射0.5×108 TU重组慢病毒LV-425;同时设立正常对照、同型抗体对照、化学药物(环磷酰胺,CTX)对照及重组慢病毒LV-NC对照。Pristane注射10天后流式细胞术分析LV-425对小鼠脾脏APC表面B7-2分子表达的干扰效应,同时检测各组小鼠脾脏中巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞以及B细胞的活化情况;通过间接免疫荧光法和Albustix试纸法监测小鼠血清自身抗体(ANA和抗ds DNA抗体)的表达水平及蛋白尿产生的情况;运用ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ及IL-4的含量,直接免疫荧光法分析小鼠肾脏中免疫复合物沉积的状况,;直接免疫荧光法分析免疫复合物在小鼠肾脏中沉积的状况,并通过光镜及透射电镜进行小鼠肾脏病理学检查。结果:1.小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒给药后,脾脏中Mφ(CD11b+)、DC(CD11c+)及B细胞(CD21+)膜型B7-2表达率显著低于建模组(p<0.05)。2.运用B7-2抗体和小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒LV-425早期干预后,小鼠脾脏APC的活化程度较建模组显著降低(p<0.05)。3.B7-2单克隆抗体与重组慢病毒LV-425早期干预抑制了小鼠ANA及抗ds DNA抗体的表达:3个月时ANA及抗ds DNA抗体均呈阴性,各干预组与建模组相比ANA及抗ds DNA抗体8个月时的阳性率和滴度均呈现显著的下降,差异具有统计学差异(p<0.05),且B7-2抗体早期干预组与重组慢病毒LV-425干预组及B7-2抗体延迟干预组之间也有显著性差异(p<0.05)。4.第8个月时B7-2抗体干预组与LV-425干预组小鼠血清中IFN-γ及IL-4的含量与建模组相比均出现下降,差异具有显著性(p<0.05)。5.B7-2抗体干预组及小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒干预组小鼠蛋白尿程度减轻:8个月时,B7-2抗体早期干预及延迟干预组、重组慢病毒LV-425干预组小鼠的尿蛋白含量均显著低于建模组,差异具有统计学意义(p<0.05);B7-2抗体早期干预组小鼠蛋白尿的程度以及阳性率低于LV-425干预组及B7-2抗体延迟干预组,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.B7-2抗体早期干预LV-425干预及B7-2抗体延迟干预均使小鼠肾脏免疫复合物沉积不同程度减少,同时也减轻了小鼠肾小球炎症损伤和坏死的程度,各组中B7-2抗体早期干预对小鼠狼疮肾炎症状具有最佳的缓解效应。结论:B7-2单克隆抗体及小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒均能抑制B7/CD28协同刺激信号,降低小鼠狼疮肾炎发病过程中免疫细胞的活化程度及减轻小鼠狼疮样肾炎模型的病理损伤,B7-2抗体的免疫干预效果优于小鼠B7-2基因RNAi重组慢病毒,具有预防狼疮样肾炎形成的作用,也具有缓解/逆转已经形成狼疮样肾炎的作用。