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目的观察在体外培养条件下丙型肝炎病毒(HCV)刺激小鼠小胶质细胞(BV2细胞)后TLR9的表达及细胞因子(IL-12、TNF-α、IL-6、MCP-1)的分泌,为进一步探讨TLR9在HCV早期感染中枢神经系统中(CNS)的免疫机制及抗病毒治疗靶点提供理论基础。方法体外培养BV2细胞,随机分为HCV阳性血清组、健康人血清组、空白对照组各20例。(1)培养24h后收集上清液,观察细胞形态,酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中IL-12、TNF-α、IL-6的水平,细胞形态及细胞因子的改变为后续不同时间点的动态观察提供依据。(2)分别在4、12、20、36h收集细胞和上清液,用逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测TLR9 mRNA的表达,流式细胞术(FCM)检测TLR9蛋白的表达,ELISA法检测不同时间点培养上清中IL-12、TNF-α、IL-6、MCP-1的含量,并用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。结果(1)显微镜下观察结果显示,体外培养的BV2细胞贴壁,细胞呈细长或梭形,胞体发出细长而有分支的突起,表面有许多小棘突。HCV阳性血清刺激后呈圆形,突起变粗短,部分细胞聚集成团。培养24h后HCV阳性血清组的TNF-α、IL-12、IL-6含量高于健康人血清组、空白对照组,差异有统计学意义( FTNF-α=72.627, FIL-12=16.465,FIL-6=19.344,P均<0.01);健康人血清组和空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。(2)RT-PCR、RT-qPCR结果显示各组不同时间点BV2细胞均有TLR9 mRNA的表达,HCV阳性血清组中TLR9 mRNA的表达高于健康人血清组、空白对照组,差异有统计学意义(FRT-PCR=17.258,P<0.01;FRT-qPCR=93.257,P<0.01),且4h的TLR9 mRNA表达量最高(P<0.05);健康人血清组和空白对照组无统计学差异(P>0.05)。各组不同时间点BV2细胞均有TLR9蛋白的表达,且HCV阳性血清组高于健康人血清组和空白对照组(F=32.762,P<0.01);HCV阳性血清组20 h时TLR9蛋白表达量最高(F=16.517,P<0.01);健康人血清组和空白对照组之间无统计学差异(P>0.05)。(3)HCV阳性血清组各时间点MCP-1、TNF-α、IL-12、IL-6的含量均高于健康人血清组、空白对照组(P均<0.05),健康人血清组和空白对照组之间无统计学差异(P>0.05)。结论(1)HCV阳性血清刺激BV2细胞使细胞形态学发生了改变,并可能诱导了BV2细胞的IL-12、TNF-α和IL-6的分泌,进一步说明HCV阳性血清刺激BV2细胞可以模拟HCV感染CNS的免疫应答机制。(2)HCV阳性血清刺激可使体外培养的BV2细胞TLR9 mRNA和TLR9蛋白表达增高,且4h TLR9 mRNA和20h TLR9蛋白表达量最高,TLR9可能参与了HCV在CNS感染中的早期固有免疫应答,但TLR9 mRNA和TLR9蛋白的表达在时间上的差异有待进一步研究。(3)HCV阳性血清刺激体外培养的BV2细胞诱导了MCP-1、TNF-α、IL-12、IL-6的分泌,TLR9可能增加了趋化因子、Th1类细胞因子和Th2类细胞因子的分泌,并在CNS感染中的免疫应答中发挥了作用。